正交设计法优选补阳还五胶囊提取工艺*

刘世军，赵海峰，唐志书△，崔春利，梁艳妮，刘红波，张　娱1陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2陕西省中药基础与新药研究重点实验室；3陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心

正交设计法优选补阳还五胶囊提取工艺*

刘世军1，2，3，赵海峰1，2，3，唐志书1，2，3△，崔春利1，2，3，梁艳妮1，2，3，刘红波1，2，3，张娱1，2，3
1陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心，陕西 咸阳 712083；2陕西省中药基础与新药研究重点实验室；3陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心

目的：优选补阳还五胶囊（黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁）的水提工艺。方法：采用L9（34）正交设计法，以加水量、提取时间、提取次数作为考察因素，以黄芪甲苷的含量、浸膏得率2个指标为考察指标。结果：最佳水提工艺是第一次加10倍量水先浸泡1小时，再煎煮2小时，第二、三次各加入8倍量的水，各煎煮1.5小时为宜。结论：优选的补阳还五胶囊水提取工艺稳定可行。

补阳还五胶囊；正交设计；黄芪甲苷；薄层扫描

补阳还五汤出自清代王清任《医林改错》，有补气、活血、祛瘀通络之功效［1］，目前已有关于糖浆剂、口服液、注射剂、冲剂［2］的工艺研究以及剂型改革初探［3］的报道。本实验采用L9（34）正交设计，以君药黄芪中所含的黄芪甲苷含量以及浸膏得率为指标，以加水倍数、提取时间、提取次数为考察因素，优选提取工艺，最大限度地保留其有效成分，以便更好地应用于临床。

1　仪器与试药

C S-9301型薄层扫描仪（日本岛津），黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：781-200210）。D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5c m）。水为纯化水，其余试剂均为分析纯。M erc k公司生产的预制板（10 c m×20 c m），展开剂：氯仿-甲醇-水（13∶6∶2）10℃以下放置过夜的下层溶液，饱和15分钟展开。显色剂：10%硫酸乙醇溶液，105℃烘5分钟。双波长反射法锯齿扫描：λs=530 n m，λR=700 n m。

2　方法与结果

2.1正交工艺设计［4］采用L9（34）正交实验。根据文献资料及大生产的实际情况，对影响水提的主要因素加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）等主要影响因素进行考察，实验因素水平见表1。按处方比例称取药材，按正交实验表安排实验。

表1　因素水平

2.2样品制备称黄芪120g，当归6g，赤芍5g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g共6味药，每份140 g，称取9份。按L9（34）实验方案，进行实验。将药材置于烧瓶中，先浸泡1小时后再煎煮提取，滤过，合并滤液，浓缩至适量，最后得1～9号提取液并定容于100mL量瓶中，备用。

2.3薄层扫描法测定黄芪甲苷的含量［5］

2.3.1对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液（实际0.49mg/mL），黄芪甲苷对照品2.45mg，溶解并转移至5mL量瓶内，加甲醇至刻度，作为对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备分别精密吸取上述正交实验的1～9号样品10 mL转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，20mL/次，合并正丁醇提取液，用氨试液提取2次，20mL/次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径1.5 c m，长12 c m），以水50mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30mL洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继用70%乙醇50mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2mL量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3.3阴性对照溶液的制备按处方比例分别称取除黄芪以外的其余药味，按照制备工艺制成缺黄芪的阴性样品，按“2.3.2”项供试品溶液的制备方法操作，制成阴性样品溶液。

2.3.4专属性实验分别取供试品溶液及阴性供试品溶液，氯仿-甲醇-水（13∶6∶2）10℃以下放置过夜的下层溶液，饱和15分钟展开，10%硫酸乙醇溶液显色，105℃烘5分钟，双波长反射法锯齿扫描：λs=530 n m，λR=700 n m。按上述条件分析，阴性样品在指标成分黄芪甲苷的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好。

2.3.5标准曲线及线性范围分别精密吸取对照品溶液（C=0.49 mg/mL）2、4、6、8、10、12、14μL，按上述色谱条件测定峰面积，结果见表2。

表2　标准曲线实验结果

以峰面积A为纵坐标，黄芪甲苷含量C（μg）为横坐标计算回归方程为：A=1 111.84C+300.27，相关系数r=0.999 9，线性范围0.980～6.860μg。标准曲线（见图1）。

图1　黄芪甲苷标准曲线

2.3.6精密度实验

2.3.6.1同板精密度精密吸取3号供试品5μL，同板点样5次，记录峰面积，RS D为1.49%，表明本方法同板精密度良好。

2.3.6.2异板精密度精密吸取3号供试品5μL，异板点样5次，记录峰面积，RS D为1.34%，表明本方法异板精密度良好。

2.3.7重复性实验精密吸取3号提取液5份，按供试品制备方法制备，点样5μL，记录峰面积、计算含量，RS D为1.40%，表明本方法重复性良好。

2.3.8稳定性实验取3号供试品，按供试品制备方法制备样品，分别在0、0.5、1、1.5、2小时记录峰面积并计算出RS D为0.55%。表明供试品在2小时内是稳定的。

2.3.9回收率实验取3号正交样品适量，加适量对照品，按供试品制备方法制备样品，测定含量，测定含量计算回收率，表明本方法回收率良好，结果见表3。

表3　回收率实验结果

2.3.10样品测定按供试品制备方法处理1～9号样品，依色谱条件测定其含量，结果见表4。

2.4总提取物的测定将1～9号提取物分别浓缩后定容于100mL量瓶中，摇匀，分别精密量取25mL，置于在105℃条件下干燥至恒重的蒸发器中，烘干至恒重，计算出总提取物（%），结果见表4。

表4　正交实验结果

2.5正交实验结果与分析从表4实验结果可以看出，对两个考察指标影响最大的均为因素C，以总提物为考察指标来看，可以认为各因素对总提取物的影响大小顺序为C＞B＞A，再从各因素水平来看（K值分析），3个因素均为K3＞K2＞K1，以黄芪甲苷含量为考察指标来看，可以认为各因素对黄芪甲苷含量的影响大小顺序为C＞A＞B，从各因素水平来看（K值分析）因素A为K3＞K1＞K2，因素B、C为K3＞K2＞K1，从以上直观分析其水提条件应为A3B3C3，实验结果及直观分析详见表4。

2.6正交实验方差分析结果考虑到大生产实际情况，有必要对各因素水平的显著性进行方差分析，表5方差分析结果表明，因素A、B、C对黄芪甲苷的含量均有显著性影响。表6方差分析结果表明，因素C、B对总提物有显著性影响，因素A几乎无影响，结合表4的直观分析，其优选工艺为A3B3C3，其工艺为第1次加10倍量水先浸泡1小时，再煎煮2小时，第二、三次各加入8倍量的水，各煎煮1.5小时为宜。见表5—6。

表5　黄芪甲苷方差分析

表6　出膏率含量方差分析

3　讨论

3.1指标成分的选择补阳还五胶囊为中药复方制剂，由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁7味中药组成。含量测定时应首选君药，本品君药为黄芪。现代药理研究显示，其所含黄芪甲苷是主要活性成分和质量控制的指标性成分，能提高人体免疫力，具有抗疲劳、抗衰老，扩张血管和扩张冠脉作用。上述作用与中医传统理论黄芪补气固表相契合，因此，以君药中有效成分作为指标有助于全面地评价提取工艺。

3.2薄层扫描方法的选择目前对于含黄芪制剂的含量测定研究，主要针对黄芪甲苷。黄芪甲苷含量测定的方法较多，主要有薄层扫描法和高效液相色谱法，笔者采用了较成熟的薄层扫描法，经过方法学考察表明，制定的测定方法重现性、精密度均良好，回收率等符合要求，整个实验过程可操作性强，能够客观地控制本品的含量。

3.3实验结果分析本实验通过正交设计优选的补阳还五胶囊最佳提取工艺为：第1次加10倍量水先浸泡1小时，再煎煮2小时，第二、三次各加入8倍量的水，各煎煮1.5小时为宜。这为该制剂的提取工艺参数确定提供了实验依据，为该制剂中药新药的开发奠定了一定的基础。

［1］ 邓中甲.方剂学［M］.北京：中国中医药出版社，2003：240.

［2］ 张德连，邵碧霞，史瑞书，等.补阳还五冲剂工艺的研究［J］.黑龙江医药，1997，10（2）：81-82.

［3］ 刘世军，熊英.补阳还五汤剂型改革初探［J］.甘肃中医，2009，22（6）：61-62.

［4］ 张丕德，龙晓英.正交设计与数据分析在药学研究中的应用［J］.广东药学院学报，2009，25（5）：546-551.

［5］ 梁溢，陈幸，黎万寿，等.还伍胶囊中黄芪甲苷的定量分析［J］.中成药，2004，26（5）：430-431.

Optim ization of Extraction Processof BuYang HuanWu Capsulesby OrthogonalDesign

LIU Shijun1，2，3，ZHAO Haifeng1，2，3，TANG Zhishu1，2，3△，CUIChunli1，2，3，LIANG Yanni1，2，3，LIU Hongbo1，2，3，ZHANG Yu1，2，3
1 ShaanxiCollaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resource Industrialization of ShaanxiUniversity of Chinese Medicine，Xianyang 712083，China；2 Shaanxi Provincial Key Lab of the Study for Traditional Chinese Medicine and New Drugs；3 Shaanxi Provincial Engineering Research Center of Rheumatism and Tumor Chinese Drugs Preparation

Objective：To optim ize water extraction technology of BuYang HuanWu capsules［HuangQi Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bunge.），DangGui（Angelica sine），ChiShao （Radix Paeoniae Rubra），DiLong （earthworm），ChuanXiong（Ligusticum chuanxiong Hort.），HongHua（Carthamus tinctorius L.），TaoRen（Prunus persica （L.）Batsch）］.Methods：L9（34）orthogonaldesign wasadopted by takingwatervolume，extraction time and extraction timesas the factors，containing quantity and extractyield as the indexes.Results：The optimalwater extraction technology is to soak forone hoursafteradding thewater in ten timesat the first time，decocting for two hours，decocting for 1.5 hours respectively after adding thewater in eight times at the second and third times.Conclusion：The optim izedwaterextraction of BuYang HuanWu capsules is stable and feasible.

BuYang HuanWu capsules；orthogonaldesign；astragaloside IV；TLC

R284.2

A

1004-6852（2016）04-0032-04

2015-02-19

陕西省重点科技创新团队计划（编号2012KCT-20）。

刘世军（1974—），男，博士学位，高级工程师。研究方向：天然产物分离，中药鉴定，中药制剂工艺与质量标准研究。

唐志书（1972—），男，博士学位，硕士研究生导师，教授。研究方向：中药高新制备技术应用研究及中药资源开发与综合利用。