雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠脊髓背根神经节中MCP-1及CCR2表达的影响

张旭东， 杨若松， 陈 伟， 蒋雯雯， 韦登明， 林 荣*（1.宁波大学医学院病理学与病原生物学系，浙江 宁波315211；2.宁波市行为神经科学重点实验室，浙江宁波315211）



雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠脊髓背根神经节中MCP-1及CCR2表达的影响

张旭东1，2， 杨若松1，2， 陈 伟1，2， 蒋雯雯1，2， 韦登明1，2， 林 荣1，2*
（1.宁波大学医学院病理学与病原生物学系，浙江 宁波315211；2.宁波市行为神经科学重点实验室，浙江宁波315211）

目的 通过检测不同剂量雷公藤内酯醇（tripto1ide，TP）对佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠的镇痛效果及其对腰5（L5）脊髓背根神经节中单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）及趋化因子受体-2（chemokine receptor2，CCR2）表达的影响，旨在探讨雷公藤内酯醇对类风湿性关节炎可能的镇痛机制。方法 50只SD大鼠随机分成5组即正常组，模型组，雷公藤内酯醇低、中、高剂量治疗组。模型组及治疗组右后足跖皮下注射0.1 mL弗氏完全佐剂造模，正常组注射0.1 mL生理盐水对照。造模后2周，治疗组大鼠采取不同剂量雷公藤内酯醇腹腔注射给药治疗（低剂量治疗组0.1 mg/kg，中剂量治疗组0.2 mg/kg，高剂量治疗组0.4 mg/kg），每天1次，共9 d。于造模前，造模后14 d，给药后9 d进行热痛阈的测定，用免疫组化检测腰5脊髓背根神经节 （dorsa1 root gang1ia，DRG）中MCP-1、CCR2的表达变化情况。结果 模型组大鼠热痛阈显著低于正常组（P＜0.01），经过雷公藤内酯醇治疗后，各治疗组热痛阈均显著高于模型组 （P＜0.05，P＜0.01）；免疫组化结果表明模型组DRG中MCP-1及CCR2阳性表达水平较正常组显著升高（P＜0.01），其中雷公藤内酯醇低剂量治疗组大鼠L5DRG中只有MCP-1阳性表达水平显著低于模型组（P＜0.01），而雷公藤内酯醇中高剂量治疗组大鼠L5DRG中MCP-1、CCR2阳性表达水平均显著低于模型组 （P＜0.01）。结论 雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎具有良好镇痛作用；雷公藤内酯醇可抑制AA大鼠DRG中MCP-1及CCR2的表达，这可能是雷公藤内酯醇产生镇痛作用机制之一。

佐剂性关节炎；雷公藤内酯醇；镇痛；背根神经节；趋化因子

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自体免疫性疾病，常伴有剧烈疼痛，严重降低患者的生存质量，止痛是治疗RA的重要环节，也是判定该病疗效的标准之一［1］。而近年来发现MCP-1及CCR2在神经病理性疼痛和炎性痛发生发展中有重要的作用［2-4］。脊髓是疼痛相关信息传递及整合的初级中枢，其背根神经节神经元的MCP-1对外周痛感受器的功能强弱有影响，MCP-1与慢性疼痛的发生发展密切相关［5-7］。雷公藤在临床上有确切的镇痛疗效，而雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠镇痛机制与大鼠脊髓背根神经节中趋化因子MCP-1及其受体CCR2表达的关系尚未见报道。

本实验通过建立AA大鼠模型，给予不同剂量雷公藤内酯醇治疗，以热痛阈、腰5（L5）节段脊髓 DRG中MCP-1及其受体CCR2的表达为检测指标，旨在探讨不同剂量雷公藤内酯醇对AA大鼠脊髓DRG中MCP-1和CCR2的影响，为雷公藤制剂的临床镇痛提供一定的理论依据。

1　材料与仪器

1.1实验动物与试剂 SD大鼠50只，雌雄各半，体质量约180～220g，宁波大学实验动物中心代购，合格证号0102013；雷公藤内酯醇由上海科卫医疗技术研究所提供（纯度为99.9%，批号20130111），用4%丙二醇溶液加热溶解；完全弗氏佐剂 （美国Sigma公司）；戊巴比妥钠 （德国Merck公司）；SABC免疫组化染色试剂盒，MCP-1、CCR2多克隆抗体原液，DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2主要仪器 ZH-LUO/B鼠尾测痛仪（正华生物仪器设备有限公司）；BM-Ⅶ包埋机 （宏业医用仪器有限公司）；HM-325石蜡切片机（德国LEICA公司）；CX40生物显微镜 （日本O1ympus公司）；JD801形态学图像分析系统（江苏捷达科技发展有限公司）。

2　方法

2.1动物分组及模型制备 大鼠喂养7 d后随机分成5组：正常组，模型组，雷公藤内酯醇低、中、高剂量治疗组。大鼠麻醉消毒后，模型组和治疗组大鼠在右后足跖皮内注射0.1mL完全弗氏佐剂诱导AA大鼠模型，正常组则在相应部位注射等量生理盐水作为对照，继发关节炎的出现标志造模成功，约要2周。造模14 d后，治疗组大鼠分别按低、中、高剂量 （0.1、0.2、0.4 mg/kg）腹腔注射雷公藤内酯醇溶液进行治疗，每日1次，连续9 d，而正常组和模型组大鼠腹腔注射等体积4%丙二醇溶液作为对照。

2.2热痛阈测定 使用光致热鼠尾测痛仪，对造模前，造模14 d，治疗9 d的大鼠进行热痛阈测定。将鼠尾测痛仪调到55℃，将鼠尾放入凹槽内，于距鼠尾尖约0.5 cm处照射致痛，记录大鼠由照射开始到鼠尾甩动的时间，连续测3次，间隔5m in以上，取平均值作为痛阈。

2.3组织病理学检查 给药后9 d，将实验动物麻醉后左心灌注处死，取踝关节，腰5节段脊髓DRG放入中性固定液中固定。固定后的踝关节流水冲洗后，经脱钙液脱钙，梯度酒精脱水，透明，浸蜡后，包埋，做HE染色；而DRG则按照说明书进行免疫组化测定趋化因子MCP-1及其受体CCR2的表达，每张切片镜下400倍下选择4个视野由JD801形态学图像分析系统测量阳性产物的积分光密度（IOD），并进行统计分析。2.4 统计学分析 结果用±s表示，采用SPSS18.0软件进行重复测量资料的单因素方差分析和独立样本t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

3　结果

3.1不同剂量雷公藤内酯醇对AA大鼠热痛阈的影响 结果见表1，造模前各组大鼠热痛阈无显著差异 （P＞0.05）。造模14 d时，正常组大鼠热痛阈显著高于模型组 （P＜0.01）；雷公藤内酯醇治疗9 d后，低、中、高剂量治疗组热痛阈均高于模型组 （P＜0.05，P＜0.01）；且中剂量治疗组疗效较低剂量治疗组明显 （P＜0.05），高剂量治疗组与低、中剂量治疗组相比，热痛阈提高更为显著 （P＜0.01）。由此可以推测低、中、高剂量的雷公藤内酯醇治疗AA大鼠9 d后，均可显著提高热AA大鼠的痛阈，且呈一定的量效关系。

表1　雷公藤内酯醇对各组大鼠热痛阈变化的影响 （±s，n=10）

表1　雷公藤内酯醇对各组大鼠热痛阈变化的影响 （±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与TP低剂量治疗组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与TP中剂量治疗组比较，△△P＜0.01

?

3.2不同剂量雷公藤内酯醇对AA大鼠踝关节滑膜组织病理学影响 图1所示为各组大鼠踝关节的HE染色图片，其中正常组大鼠踝关节腔边缘清晰，关节软骨表面光滑，未见滑膜组织增生以及炎性细胞浸润，结构正常；模型组大鼠踝关节出现滑膜增生，滑膜细胞数量增多，同时伴有大量炎性细胞浸润；经雷公藤内酯醇治疗后，治疗组大鼠滑膜组织的炎性细胞浸润较模型组有明显减少，炎症反应程度逐渐减轻，随着雷公藤内酯醇治疗剂量增加，效果愈加明显。

3.3不同剂量雷公藤内酯醇对AA大鼠DRG中MCP-1及其受体CCR2的影响 雷公藤内酯醇治疗9 d后，大鼠L5DRG中模型组MCP-1及CCR2免疫阳性积分光密度显著高于正常组（P＜0.01），低剂量治疗组MCP-1免疫组化阳性产物积分光密度较模型组显著降低 （P＜0.01），而中、高剂量治疗组MCP-1及CCR2免疫组化阳性产物积分光密度均较模型组显著下降 （P＜0.01），趋势呈一定的量效关系。结果见表2～3。

表2　各组大鼠L5 DRG中MCP-1的表达（±s）

表2　各组大鼠L5 DRG中MCP-1的表达（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01

?

4　讨论

谷氨酸参与痛觉信息的传递，是介导痛觉信息传递最主要的神经递质之一，NO是谷氨酸兴奋作用的细胞内信使，介导谷氨酸的神经毒性，同时又与多种递质相互作用，加强疼痛信号在脊髓后角的调制，产生病理性疼痛［8］，诱导型一氧化氮合酶 （iNOS）是一种生成NO的限速酶，但iNOS基因一般不表达，只有在如肿瘤坏死因子、白介素-1等内毒素和多种细胞因子刺激下，才会转录翻译和表达。NMDAR是谷氨酸受体的一个类型，属于离子型受体。关节炎患者的外周损伤释放缓激肽等物质使感受器激活，膜去极化，而炎性介质如NO、PG等进一步加强外周感受器的敏化状态，使感受器持续产生伤害性冲动传入脊髓，致使脊髓神经元兴奋，大量释放P物质 （SP）和谷氨酸。谷氨酸可直接激活突触后膜的NMDAR导致Ca2+内流激活蛋白激酶C（PKC），激活的PKC使细胞膜磷酸化NMDAR，提高NMDAR兴奋性并增加Ca2+内流；而NMDAR的激活与Ca2+浓度的升高又会使PKC活性增强，从而形成正反馈使疼痛持续存在。NMDAR1激活后还可调节SP、谷氨酸等神经递质的突触前释放，表明NMDAR1可能参与了中枢敏化的形成［9］。

图1　各组大鼠踝关节HE染色图 （×100）

表3　各组大鼠L5 DRG中CCR2的表达（±s）

表3　各组大鼠L5 DRG中CCR2的表达（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01

阳性产物积分光密度正常组　10　30.9±9.49组别　n *模型组　10　49.2±16.01 TP低剂量治疗组　10　41.1±21.07 TP中剂量治疗组　10　31.3±9.85*TP高剂量治疗组　10　19.0±6.99*

本实验室既往的研究［10-11］表明 AA大鼠脊髓背角和DRG中iNOS、SP、IL-1β、TNF-α、NMDAR1表达较正常对照组显著上调，而雷公藤内酯醇对这些细胞因子表达的抑制作用可能是雷公藤内酯醇的镇痛作用机制之一。这显示雷公藤内酯醇具有多靶点作用的特点。

MCP-1及其受体CCR2是近年来较为热门的趋化因子，周围组织炎症或神经损伤后DRG中神经元可大量分泌MCP-1，而周围小胶质细胞上的CCR2受体与之结合后通过信号传递传导通路刺激小胶质细胞迅速活化增殖并释放出大量细胞因子，进一步引发星形胶质细胞的活化。小胶质细胞和星形胶质细胞活化后相互激活进而产生协同作用，释放多种致痛物质如iNOS、SP引发神经元兴奋性升高的同时，又降低神经元的兴奋阈值，以至于正常时不能产生疼痛的低强度刺激也可致痛从而形成中枢敏化现象，加上疼痛的正反馈的共同作用使慢性痛持续存在［3，12-14］。

本实验结果显示，造模14 d时，正常组大鼠热痛阈显著高于模型组；而免疫组化结果显示模型组大鼠DRG中MCP-1及CCR2阳性产物表达水平均显著高于正常组，提示在AA大鼠造模时，关节的炎症反应使感受器受到外界刺激后疼痛信息传入增加，导致DRG神经元内MCP-1及CCR2表达增加，可能参与了AA大鼠关节痛的发生。经雷公藤内酯醇治疗后，低、中、高剂量治疗组大鼠MCP-1及CCR2的阳性表达均有显著下降，且呈一定的量效关系的趋势。分析这一结果产生的可能原因为：在关节炎形成后，雷公藤内酯醇抑制了关节局部炎症反应及DRG中MCP-1、CCR2的表达，使外界刺激后疼痛信息传入也相应减少而发挥镇痛作用。

综上所述，雷公藤内酯醇的镇痛机制可能与其抑制背根神经节DRG中MCP-1及CCR2的表达有关，具体的分子机制还有待进一步探究加以明确。

［1］李满意.类风湿关节炎的疼痛症状治疗浅识［J］.中国民族民间医药，2010，19（22）：73-74.

［2］Thacker M A，C1ark A K，Bishop T，et al.CCL2 is a keymediator ofmicrog1ia activation in neuropathic pain states［J］. Eur JPain，2009，13（3）：263-272.

［3］Tang J，Zhu C，Li ZH，et al.Inhibition of the spina1astrocytic JNK/MCP-1 pathway activation corre1ates with the ana1gesic effects of tanshinone IIA su1fonate in neuropathic pain［J］. JNeuroinflammation，2015，12：1742-2094.

［4］Carva11o L，Lopez L，Che F Y，et al.Buprenorphine decreases the CCL2-mediated chemotactic response ofmonocytes［J］. J Immunol，2015，194（7）：3246-3258.

［5］Jaggi AS，Singh N.Therapeutic targets for the management of periphera1 nerve injury-induced neuropathic pain［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets，2011，10（5）：589-609.

［6］Seifert F，Maihofner C.Functiona1 and structura1 imaging of pain-induced neurop1asticity［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2011，24（5）：515-523.

［7］Staud R.Is it a11centra1sensitization？Ro1e of periphera1 tissue nociception in chronicmuscu1oske1eta1pain［J］.Curr Rheumatol Rep，2010，12（6）：448-454.

［8］Cury Y，Pico1o G，Gutierrez V P，et al.Pain and ana1gesia：the dua1effect of nitric oxide in the nociceptive system［J］.NitricOxide，2011，25（3）：243-254.

［9］Kombian S B，Anantha1akshmi K V，Zidichouski J A，et al. Cocaine sensitization does not a1ter SP effects on 1ocomotion or excitatory synaptic transmission in the NAc of rats［J］.Neuropharmacology，2012，62（2）：825-832.

［10］陈 伟，张旭东，逯卓卉，等.雷公藤内酯醇对AA大鼠脊髓和背根神经节中iNOS，SP表达的影响［J］.中国中药杂志，2014，39（9）：1675-1679.

［11］韦赟博，林 荣，陈 伟，等.雷公藤内酯醇对AA大鼠脊髓和背根神经节中NMDAR1及BSI-B4结合位点表达的影响［J］.中药材，2014，37（11）：2047-2050.

［12］徐振华，杨建平，胡计嬅，等.趋化因子受体CCR2拮抗剂在大鼠骨癌痛治疗中的可能机制［J］.中国药理学通报，2014，30（4）：510-513.

［13］Wa1sh D A，McWi11iams D F.Pain in rheumatoid arthritis［J］. Curr Pain Headache Rep，2012，16（6）：509-517.

［14］Pavkova Go1dbergova M，Lipkova J，Pavek N，et al.MCP-1 chemokines and factors describing rheumatoid arthritis［J］.Mol Immunol，2012，52（3）：273-278.

R285.5

B

1001-1528（2016）06-1390-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.040

2015-09-08

宁波市自然科学基金项目 （2014A610247）；宁波大学学科项目 （XKL14D2102）

张旭东（1991—），男，硕士生，从事类风湿性关节炎防治机理的研究。E-mai1：zhangxudong9134@sina.cn

林 荣 （1978—），男，实验师，从事类风湿性关节炎防治机理的研究。Te1：（0574）87609590，E-mai1：1inrong@nbu. edu.cn