两种不同刺激剂对鸡淋巴细胞分泌细胞因子的影响

刘洪明，王官晓，王俊卿，杨玉华，郭善娜，徐晓静（1.甘肃农业大学，甘肃兰州　730070；.山东省烟台市动物卫生监督所，山东烟台　64000）

教材讲义连载

两种不同刺激剂对鸡淋巴细胞分泌细胞因子的影响

刘洪明1，2，王官晓2，王俊卿2，杨玉华2，郭善娜2，徐晓静2
（1.甘肃农业大学，甘肃兰州730070；2.山东省烟台市动物卫生监督所，山东烟台264000）

［目的］比较不同刺激剂刀豆素A（Con A）和植物凝素（PHA）对鸡淋巴细胞分泌细胞因子的影响。［方法］首先，应用淋巴细胞分离液分离健康鸡的外周血淋巴细胞，应用2种不同的刺激剂Con A和PHA刺激48 h后收集细胞，抽提刺激培养细胞RNA，反转录。其次，应用实时定量PCR方法检测不同刺激剂对鸡淋巴细胞因子mRNA的表达。最后，用分子生物学软件对数据进行比对分析。［结果］分离到纯度和活细胞较高的鸡淋巴细胞。荧光定量PCR结果显示 ：Con A刺激的淋巴细胞因子表达量比PHA刺激细胞的表达量明显升高（P＜0.01）；PHA刺激的细胞因子除IL-4的表达量明显升高（P＜0.01）外，其他细胞因子表达量无明显升高（P＞0.05）。［结论］Con A刺激淋巴细胞后，可以提高细胞因子的表达，刺激效果优于PHA。这些实验结果为进一步体外研究鸡淋巴细胞及其功能提供了方法。

鸡T细胞；细胞因子；荧光定量PCR

T淋巴细胞是主要的淋巴细胞，其分泌的细胞因子不仅可以直接参与机体免疫反应，还能调节免疫细胞功能。根据 CD4和CD8分子表达，可将成熟T细胞分为CD4+或 CD8+细胞，其中CD4+细胞可根据表达细胞因子的不同分为Th1和Th2细胞［1］。Th1与抗胞内感染相关，主要分泌IFN-γ、IL-2细胞因子。IFN-γ可以提高嗜中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬能力，提高NK细胞对细胞毒性的杀伤作用［2］，表现出抗肿瘤、抗病毒活性，促进Th1免疫反应［3］；Th2辅助体液免疫反应［4］，主要分泌IL-4、IL-10、IL-12等细胞因子。其中IL-4是促进T细胞向Th2分化的重要细胞因子。IL-4作为Th2细胞的特征细胞因子，可以促炎、活化B细胞、促Th2细胞活化，临床上显示有抗肿瘤和缓解自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎）的作用［5］。IL-10是一种重要抗炎症因子，是一种多效细胞因子，可以刺激B细胞的增殖和稳定，以及MHCⅡ的表达、IgA和IgG的分泌，增强细胞毒T细胞的发育。其抑制作用表现为在免疫应答及炎症反应时，抑制免疫细胞活性，降低表达的免疫分子产量，从而使免疫系统及个体水平保持平衡［6］。IL-12的主要生物学活性包括：对T细胞、NK细胞及造血细胞的促进作用，诱导Th细胞分化，调节Th1/Th2细胞之间的平衡，通过诱导特异性CTL的产生起到抗病毒及抗肿瘤作用［7］。Con A和PHA是常用的T细胞刺激剂，可以刺激细胞的增殖和分型，已广泛应用于哺乳动物、禽类、水生动物等［8-10］，对体外培养和研究T细胞具有重要作用。有研究表明Con A和PHA还可以用来筛选细胞免疫缺陷，且Con A效果优于PHA［11］。两种刺激剂均可以很好地刺激T细胞增殖，但是对细胞增殖后细胞因子表达不清楚。本实验用两种刺激剂对鸡淋巴细胞进行刺激，用荧光定量方法检测刺激后T细胞因子的表达，为进一步研究鸡淋巴细胞提供了方法。

1　材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂。改良型RPMI-1640培养基，购自北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司； 植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（Con A），购自Sigma公司；鸡外周血淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物制品科技有限公司；RNAiso Plus（Total RNA提取试剂），购自宝生物工程（大连）有限公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover，购自TOYOBO公司；寡核苷酸引物，由华大基因合成；GoTaq® qPCR Master Mix，购自北京Promega公司。

1.1.2 实验动物。15日龄公鸡，购自安徽某鸡场。

1.2 方法

1.2.1 鸡外周血淋巴细胞分离和成活率检测。取鸡抗凝血5 mL，在50 mL离心管中加入等体积的鸡外周血淋巴细胞分离液；将血液样本缓慢加于分离液之液面上，18～22 ℃，400 g 离心20 min， 弃上清液；用吸管小心吸取分离液层及淋巴细胞层，置于另一新离心管（50 mL）内，加入10 mL 细胞洗涤液混匀，250 g离心10 min，弃上清；用吸管以5 mL细胞洗涤液重悬所得细胞，250 g离心10 min，弃上清，得下层细胞。将获得的细胞悬液按照1：20稀释5个细胞孔，每孔100 µL。每孔加入10 µL 0.4%的台盼蓝，3分钟后显微镜下分别对活细胞和死细胞计数。活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

1.2.2 细胞收集计数并接种培养细胞。用含10% FBS（体积）的RPMI1640完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为4×106/mL；将细胞分为3份，分别加入不同的刺激剂Con A、PHA（浓度均为5 mg/mL）调整刺激剂的终浓度为12.5 µg/mL，并设置阴性对照；接种于96孔细胞培养板，37 ℃、5% CO2条件下，培养48 h后收集细胞。

1.2.3 RNA的提取和cDNA的合成。用冷PBS （pH7.4）洗涤细胞3次；按试剂盒的操作说明，分离获得细胞的总mRNA；检测其D260nm/ D280nm比 值和D260nm/D230nm比值， 并将mRNA的质量调整至0.5 pg～0.5 ng之间。按mRNA逆转录试剂盒的操作说明，合成第一链cDNA。

1.2.4 荧光定量PCR检测相关细胞因子的表达。以获得的cDNA为模版进行荧光定量PCR反应。Nuclease-Free Water 7.2 µL，上游引物（10 µM）0.4 µL，下游引物（10 µM）0.4 µL，GoTaq® qPCR Master Mix 10 µL，cDNA（模板）2 µL，稀释cDNA（模板）浓度为40 ng/µL。每个样品设置3个重复。扩增步骤依次为 95 ℃预变性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。在60 ℃时收集荧光，总反应体积为20 µL。

1.2.5 荧光定量PCR结果的计算。采用比较CT法（ΔΔCT），相对表达量=2-ΔΔCT=2-（ΔCT处理-ΔCT对照）=2-［（CT处理-CT内参）-（CT对照-CT内参）］，数据取3次重复的平均值［12］。计量数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 11.5软件分析，计量资料采用t检验，P＜0.05为差异有显著意义。设置未刺激的淋巴细胞为阴性对照，细胞为对照样品。将对照样品mRNA的相对表达量设为1，试验样品的2-ΔΔCT值即为相对表达量。

2　结果

2.1 所分离到的外周血活淋巴细胞数较多

对分离的鸡淋巴细胞进行台盼蓝染色计数，结果成活的淋巴细胞抗台盼蓝，细胞透亮，死细胞被台盼蓝染成蓝色，不透明。显微镜观察显示，每个细胞培养孔内透亮细胞的数目均大于95%。这说明所获得的淋巴细胞完全能够满足后续的实验要求。

2.2 淋巴细胞中抽提的RNA完整性好

对Con A、PHA刺激和阴性对照细胞中提取的总RNA，经超微量核酸蛋白测定仪检测，结果未刺激淋巴细胞RNA浓度为230 mg/µL，D260nm/ D280nm比值均为1.8，D260nm/D230nm比值均大于2.2。Con A刺激的淋巴细胞浓度为190 mg/µL，D260nm/D280nm比值均为1.9，D260nm/D230nm比值均大于2.1；PHA刺激的淋巴细胞浓度为220 mg/µL，D260nm/D280nm比值均为1.8，D260nm/ D230nm比值均大于2.2。这表明mRNA纯度较高，经1.0%琼脂糖核酸胶电泳显示，RNA完整度较高（图1），可以用于后续的cDNA合成。

2.3 不同刺激后细胞因子mRNA的相对表达量

以未刺激淋巴细胞作为对照组，参照值设为1。 Con A刺激下，IL-4、IL-10、IFN-γ的相对表达含量极显著（P＜0.01）或显著（P＜0.05）增加，分别为10.3、1.66、1.73，IL-12为1.88±0.86差异不显著（P＞0.05）；在PHA刺激下，IL-4相对表达含量增加为5.24，与未刺激淋巴细胞组差异极显著（P＜0.01），IL-10、IL-12、IFN-γ的相对表达含量分别为0.74、0.94、1.11，差异不显著（P＞0.05）。具体数值见表1。

表1　刺激剂刺激和未刺激细胞因子的mRAN表达量

3　讨论

PHA主要成分为植物多肽，属高分子糖蛋白类，有促进淋巴细胞有丝分裂的作用，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子。Con A是四聚体球蛋白，是一种凝集素，具有强力的促有丝分裂作用，有较好的促淋巴细胞转化反应作用，能选择性激活抑制性T淋巴细胞［13］。PHA、Con A都是常用的有丝分裂原，可在一定浓度范围内刺激淋巴细胞转化为淋巴母细胞，从而使其增殖分化，发挥相应细胞功能。本实验将刺激剂浓度设为12.5 µg/mL，可有效刺激T细胞的分化［14-16］。Con A和PHA与T淋巴细胞受体结合时，如果细胞过多，由于生长空间有限，刺激剂就只能与一部分细胞的受体结合，刺激这部分细胞活化；如果细胞过少，T淋巴细胞仅占淋巴细胞的一小部分，由于受体数量有限，使刺激剂的结合率降低，部分刺激剂未发挥作用，T淋巴细胞增殖的效率就降低。因此将细胞密度调整为4×106/mL。

由结果可知，Con A刺激后，IL-4、IL-10、IFN-γ的相对表达含量显著增加。IL-12增加量虽未有显著性意义，但其平均值（1.88）依旧高出阴性对照；PHA刺激后，仅有IL-4的相对表达量极显著增加，IL-10、IL-12、IFN-γ皆无显著差异。由此可得出Con A刺激后的细胞因子表达效果优于PHA。这可能是由于有丝分裂原Con A在刺激淋巴细胞因子方面具有优势。

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（责任编辑：朱迪国）

Effect of Two Kinds of Stimuli on Cytokines Secreted by Chicken Peripheral Blood Lymphocytes

Liu Hongming1，2，Wang Guanxiao2，Wang Junqing2，Yang Yuhua2，Guo Shanna2，Xu Xiaojing2
（1.Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070；2.Yantai Animal Health Inspection Institution，Yantai，Shandong 264000）

［Objective］ To compare the effect of two kinds of stimuli，concanavalin A（Con A）and phytohemagglutinin（PHA）on cytokine secreted by chicken lymphocyte. ［Methods］ First，peripheral blood lymphocytes from chickens were separated by lymphocyte separation liquid and cultured with Con A and PHA for 48 h，respectively，then the cell RNAs were extracted and the reverse transcription was carry out. Secondly，a real time PCR was performed for detection of the RNA transcription level in the chicken lymphocytes stimulated by Con A and PHA. Finally，the effect of two kinds of stimuli on cytokines secretion was compared with molecular biology software. ［Results］ Chicken lymphocytes with higher purity and a survival rate were obtained with the used method. The transcription levels of tested cytokines stimulated by Con A were evidently higher than that by PHA（P ＜ 0.01）. Moreover，PHA could not increase cytokine transcription levels（P＞0.05）except of IL-4（P ＜ 0.01）. ［Conclusion］ Con A can enhance the transcription levels of cytokine genes and is a be better stimulus for chicken lymphocytes than PHA. All these results provide methods for the further study of chic ken lymphocytes in vitro.

chicken T cell；cytokine；fluorescence quantitative PCR

S831

B

1005-944X（2016）08-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.025

国家自然科学基金青年项目（31201888）；国家自然科学基金面上项目（31572496）