鸡传染性支气管炎病毒广西株N基因的克隆与序列分析

屈素洁，邹联斌，胡　杰，粟艳琼，尹彦文，陆文俊，李　军，施开创，莫胜兰（广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁　530001）

鸡传染性支气管炎病毒广西株N基因的克隆与序列分析

屈素洁，邹联斌，胡杰，粟艳琼，尹彦文，陆文俊，李军，施开创，莫胜兰
（广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁530001）

参照GenBank中鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核酸序列设计了1对引物，利用 RT-PCR 扩增了1个广西分离株的N基因cDNA片段，并将其克隆到pMDl8-T载体中。序列分析结果表明，N基因序列全长为1 230 bp，编码1条409个氨基酸组成的多肽；分离株与国内外IBV参考毒株相比，核苷酸同源性为83.8%～99.9%，氨基酸同源性为88.4%～99.6%；分离株与LX4株、BJ株关系较近，与疫苗株处于不同的进化分支，亲缘关系较远，是新的IBV变异株。

鸡传染性支气管炎病毒；N 基因；基因克隆；序列分析

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的鸡的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病，各日龄鸡均可感染， 主要侵害呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统，是目前危害世界养禽业的重要传染病之一［1-3］。该病毒的特点是变异频繁，血清型复杂，所致疾病的临床表现差异很大。该病毒不同血清型间没有或仅有部分交叉免疫性，单一血清型疫苗只能对同型IBV 感染产生免疫力，对异型毒株只能提供部分保护力或根本无保护力，容易导致免疫失败，所以根据当地流行的血清型选择疫苗尤为重要［4］。

IBV是冠状病毒科冠状病毒属成员，为单股正链RNA病毒。该病毒基因组的高突变性，导致了新基因型和变异株不断出现［5-6］。IBV含有3种主要结构蛋白，即纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）和核蛋白（N）。N 蛋白作为主要结构蛋白，具有很强的免疫原性，是IBV诱导体液免疫应答、细胞免疫应答的重要免疫原［7］，其主要功能是包裹核酸，使之易于装配于核衣壳中。本研究对1株IBV广西分离株进行了N基因全序列的测定和分析，以期为我国IBV的分子流行病学研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和鸡胚。IBV广西分离株（Guangxi156）为本实验室2014年从广西某地采集的，大量可疑组织病料中分离出来的1株具有一定地方代表性的毒株，由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心保存；SPF鸡胚由广东华农动物保健品股份有限公司提供。

1.1.2 试剂。RNA提取试剂盒、TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0 、 胶 回 收 试 剂 盒、pMDl8-T Simple Vector，均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DH5α感受态，购自Tiangen；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计

参照GenBank中IBV的N基因序列，设计1对引物N1、N2，用于扩增N基因全长。引物由大连宝生物公司合成，序列为：N1：5'-TGTCA TGGCAAGCGGTAAGG-3'；N2：5'-TACTCAAAGTTCA TTCTCTC -3'。

1.3 IBV的增殖及其RNA的提取

将Guangxi156株接种10日龄SPF鸡胚，37 ℃培养36 h后（弃24 h内死胚），无菌收集尿囊液，4 ℃、5 000 r/min 离心30 min，取上清液，27 000 r/min 离心2 h，弃去大部分上清液（管底留大约1 mL），吹打混匀，即得病毒液。取病毒200 µL，用RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，操作方法按说明书进行。

1.4 病毒N基因的RT-PCR扩增

1.4.1 N基因cDNA的合成。按TaKaRa公司提供的TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0使用说明书进行反转录。置-20 ℃保存备用。

1.4.2 N基因cDNA的PCR扩增。PCR反应体系为：5×PCR buffer 10 µL，TaKaRa Ex Taq 0.25 µL，上、下游引物各1 µL（10 µmol/L），cDNA模板10 µL，加ddH2O至50 µL。反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取产物5～10 µL，用1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。

1.5 N基因克隆、鉴定和测序

产物纯化连接pMDl8-T载体后，转化至DH5α感受态细胞，进行阳性克隆的筛选与鉴定。以重组质粒为模板，N1、N2为引物，对所提取的质粒进行PCR鉴定。将阳性重组质粒送至TaKaRa公司进行测序。

1.6 N基因序列同源性比较与进化树分析

将测得的N基因核苷酸序列及据其推导的氨基酸序列，与GenBank中收录的H120、H52、D41、W93、ZJ981、SD0612、Ark99、LX4、BJ、K069 -01、CU-T2、Gray、Beaudette、TW97-4、D1466、Vic S、M 41 （GenBank 登录号分别为AY028296、AF35231、AY846837、AY842861、GQ149079、EU362620、M85244、A Y338732、A Y31965、A Y790344、U498558、M85245、NC-00145、NC-001451、A Y363965、U52594、DQ834384）等17个IBV毒株 N 基因的核苷酸及其编码的氨基酸序列，用 DNAStar和BLAST 软件进行同源性比较及序列分析。

2　结果

2.1 N基因的RT-PCR扩增

经琼脂糖凝胶电泳，N基因的RT-PCR产物大小约1.2 kb，与预期扩增片段大小相符（图1）。

2.2 N基因克隆与鉴定

将重组质粒进行PCR鉴定，电泳结果显示扩出1条约1.2 kb的片段，与RT-PCR结果相一致，表明目的基因已克隆到质粒载体上。

2.3 N基因的克隆测序及序列分析比较

将挑选出的阳性克隆进行序列测定，经拼接后得到IBV广西分离株N基因的ORF全核苷酸序列。将获得的Guangxi156株的N基因序列提交GenBank，序列登录号为KT002188。N基因ORF全长1 230 bp，编码409个氨基酸。与国内外IBV参考株进行同源性比较，发现分离株与国内外IBV参考株的核苷酸序列同源性为83.8%～99.9%，其中与BJ株的同源性最高，为93.3%，与疫苗株H120、H52等的同源性较低，在97.2%～88.5% 之间。分离株与国内外IBV参考毒株的氨基酸同源性在88.4%～99.6%之间（图2）。与17株参考毒株的N基因序列相比，Guangxi156株无碱基的缺失和插入现象，但存在基因突变，在228、281、320、322aa有4个半胱氨酸（Cys）。另外，N 蛋白内部还2个潜在的糖基化位点。

图1　N基因的RT-PCR扩增结果

图2　IBV广西分离株与参考株N基因氨基酸同源性比较（%）

2.4 N基因的进化分析

根据IBV N基因的核苷酸差异性，将Guangxi156株与国内外已发表的17个毒株建立遗传进化树。结果表明，Guangxi156株与国内的LX4株和BJ株关系较近，与其余IBV毒株的亲缘关系均较远，表明分离株可能为变异株（图3）。

图3　IBV N 基因的遗传进化树

3　讨论

近年来，我国IB流行呈上升趋势，尤其是肾型、腺胃型IB已蔓延到许多地区，造成了严重的经济损失。目前，一般都采用弱毒疫苗对IB进行免疫预防，而自然条件下疫苗毒株与野生毒株之间可发生重组，因此IB 已成为养禽业最难控制的疫病之一。早期的分子生物学研究认为，IBV的变异主要发生于S1 基因，而N基因则相对保守，尤其是中间区域［8］。但近年来的报道表明，类似于S1基因，N基因也存在缺失和插入等变异现象，其中有些变异可能存在于N蛋白某些抗原表位及功能区域，从而可能改变病毒的某些生物学特性［9-13］。因此，N 基因分子特征研究对 IBV 遗传衍化及分子流行病学的研究具有重要的作用。

本试验对IBV分离株Guangxi156的N基因进行了克隆和序列测定，并将序列与 GenBank中公布的17株IBV 序列的N基因进行了比较分析，结果表明，Guangxi156株 N 基因长度为1 230 bp，编码409个氨基酸残基，不存在基因的插入和缺失，但存在遍及整个N基因的散在点突变，在228、281、320、322aa有4个半胱氨酸（Cys）。这与文献报道的相同，说明半胱氨酸位置与数目、N 蛋白的结构和功能有着十分密切的关系。它们的改变可能直接影响到N蛋白的结构和功能。另外，N 蛋白内部含2个潜在的糖基化位点。分离株与国内外IBV 参考株的核苷酸序列同源性为83.8%～99.9%，其中与BJ株的同源性最高，为93.3%，与疫苗株H120、H52等的同源性较低，在97.2%～88.5%之间。分离株与国内外IBV参考毒株氨基酸的同源性在88.4%～99.6%之间。本研究对IBV广西分离株的N糖蛋白的基因序列进行遗传发育进化树绘制，表明Guangxi1566株与国内的LX4、BJ和SD0612株关系较近，与其余IBV毒株的亲缘关系均较远，表明分离株可能是国内流行的鸡肾型IBV的1个新变异株。本研究对IBV广西分离株N基因进行克隆和序列测定，为IBV广西分离株遗传变异分析和分子流行病学调查提供了重要材料，也为IBV综合防制措施的制订提供了依据。

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（责任编辑：朱迪国）

Cloning and Sequence Analysis on N Gene of an Infectious Bronchitis Virus Guangxi Isolate

Qu Sujie，Zou Lianbin，Hu Jie，Su Yangqiong，Yin Yanwen，Lu Wenjun，Li Jun，Shi Kaichuang，Mo Shenglan
（Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention，Nanning，Guangxi 530001）

One pair of primers for amplifying the N gene of IBV based on the sequence in GenBank was designed. The cDNA fragments of N gene of IBV strain isolated from Guangxi province were amplified by RT-PCR，then the amplified fragments were cloned into pMDl8-T vector and the recombinant plasmids were sequenced. The results showed that the N gene from all of the IBV isolates consisted of 1230 bp，coding for 409 amino acid. Compared with that of the other published IBV N genes，the homology of nucleotide and amino acid sequence of the isolate were 83.8%～99.9% and 88.4%～99.6% respectively. The isolate strain was closely related to LX4 and BJ and had relatively distant phylogentic relationship with the immune strain which was grouped in other clade. These results suggested that the isolate was a new variant of IBV.

avian infectious bronchitis virus；N gene；genetic cloning；sequence analysis

S852.65

A

1005-944X（2016）08-0082-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.023

广西区水产畜牧兽医局科技项目（桂渔牧科1204935）

莫胜兰