清肺口服液对RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影响*

胡婵婵　袁　斌△　周立华　徐建亚　李江全　王明明　孔　飞（.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 009；.南京中医药大学，江苏 南京 009）



·研究报告·

清肺口服液对RSV感染小鼠Treg/Th17及IL-2和IL-17水平的影响*

胡婵婵1袁斌1△周立华2徐建亚2李江全2王明明2孔飞1
（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学，江苏 南京 210029）

目的 观察清肺口服液对呼吸道合胞病毒（RSV）感染小鼠Treg/Th17细胞平衡的影响及对白介素-2 （IL-2）和白介素-17（IL-17）表达的影响。方法 将50只BABL/c小鼠按随机数字法分为空白组、模型组、清肺低剂量组（1.33 g/mL）、清肺高剂量组（4 g/mL）、利巴韦林组，每组10只。用RSV（Long株）滴鼻48 h后，经口灌胃分别给予相应药物及等量0.9%氯化钠注射液刺激，24 h后处死小鼠，立即取小鼠肺组织行病理分析，ELISA方法检测肺泡灌洗液（BALF）中IL-2、IL-17的含量，流式细胞术方法检测小鼠脾脏细胞中Treg、Th17细胞的表达含量。结果 与空白组相比，模型组的Treg/Th17及IL-2的水平下降（P<0.01），IL-17的水平升高（P<0.01）；与模型组相比，各给药组的Treg/Th17升高（P<0.05），IL-2水平升高（P<0.01），IL-17的水平下降（P<0.01）；与利巴韦林组相比，清肺组IL-2水平升高（P<0.01），清肺高剂量组Treg/Th17升高（P<0.05），IL-17的水平下降（P<0.01），清肺低剂量组Treg/Th17下降（P<0.01），IL-17的水平升高（P<0.01）。结论 清肺口服液可以调节Treg/TH17细胞的平衡，并上调RSV感染小鼠IL-2的表达水平及下调IL-17的水平，从而发挥其抗RSV的作用。

清肺口服液RSVTreg/Th17IL-2IL-17

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Qingfei oral liquid on the expression of Interleukin（IL）-2，Interleukin（IL）-17 and the balance of Treg/Th17 in mice's lung tissue infected with respiratory syncytial virus （RSV）.Methods：Fifty BABL/c mice were classified into five groups randomly：the control group，the model group，Qingfei oral liquid low dose group（1.33 g/mL）and high dose group（4 g/mL），Ribavirin group，ten mice in each group.Mice were molded with RSV（long strain）virus and given 48-hours'cultivation.24hours later，they were killed and the lung tissue was taken for pathological analysis immediately.ELISA was used to test the expression levels of IL-2 and IL-17 in BALF and flow cytometry test to the level of Treg and Th17 in the spleen. Results：Compared with the control group，the level of IL-2 and Treg/Th17 decreased and the level of IL-17 increased in the model group（P<0.01）；compared with the model group，both Qingfei oral liquid groups and Ribavirin group showed a significant increase in the expression of Treg/Th17（P<0.05）and IL-2（P<0.01），a decrease in expression of IL-17（P＜0.01）；compared with Ribavirin group，Qingfei oral liquid groups showed a significant increase in expressions of IL-2（P<0.01）.Qingfei Oral Liquid high dose group showed an increase in expression of Treg/Th17（P<0.05）and a decrease in expressions of IL-17（P<0.01）.Qingfei oral liquid low dose group showed a decrease in expression of Treg/Th17（P<0.05）and an increase in the expressions of IL-17（P< 0.01）.Conclusion：Qingfei oral liquid can regulate the balance of Treg/Th17，increase the expressions of IL-2 and decrease the expressions of IL-17 in the lung tissue of RSV infected mice，through which it can play a role of anti-RSV.

【Key words】Qingfei oral liquid；RSV；Treg/Th17；IL-2；IL-17

呼吸道合胞病毒（RSV）是肺炎患儿中检出率最高的病毒［1］，也是引起婴幼儿患病和死亡的重要原因［2］，大约有90%的儿童在2岁之内感染过RSV［3］。目前西医治疗尚缺乏特异性方案，中医药在提高免疫力、抗病毒、改善呼吸道症状等方面有独特优势。中药制剂清肺口服液是在经方麻杏甘石汤的基础上加减而成，具有开肺化痰、解毒活血之功效，临床已证实其对RSV肺炎具有良好的效果［4-5］。本实验通过建立RSV感染的小鼠模型，观察清肺口服液对RSV感染的小鼠白介素-17（IL-17）、白介素-2（IL-2）及Treg/Th17表达的影响，探讨清肺口服液治疗RSV感染的作用机制，以期为RSV感染的临床治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物及分组取6～8周龄雌性BALB/c小鼠50只，体质量（20±2）g，购于北京维通利华实验动物技术中心，合格证：SCXK（京）2012-0001。将50只小鼠按照随机数字表法分为空白组、模型组、清肺低剂量组、清肺高剂量组、利巴韦林组，每组各10只。

1.2病毒株呼吸道合胞病毒A亚型 （Long株），由武汉国家典型培养物保藏中心提供，保存于南京中医药大学第一临床医学院实验研究中心。

1.3药物与试剂清肺口服液：炙麻黄4 g，杏仁10 g，生石膏24 g，葶苈子6 g，桑白皮10 g，紫花前胡10 g，拳参12 g，制僵蚕6 g，丹参6 g，虎杖12 g。按照2010年版的《中华人民共和国药典》中方法，制成质量浓度相当于生药1.33 g/mL和4 g/mL两种剂量的水煎剂（根据人与动物等效剂量折算公式得出）。新博林颗粒（利巴韦林颗粒），由四川百利药业有限责任公司生产，规格：50 mg/袋。国药准字：H51023508。批号：090532。配成质量浓度相当于生药0.0025/mL。胎牛血清及培养基（维森特生物技术有限公司），ELISA试剂盒（上海联硕生物科技有限公司），流式细胞术试剂盒：Mouse Treg/TH 17 Phenotyping Kit（出品：BD Pharmingen），Leukocyte Activation Cocktail，with BD Golgiplug（出品：BD Pharmingen），Stain Buffer（FBS）（出品：BD Pharmingen）。

1.4仪器低温高速离心机Centrifuge 5810R；酶标仪EXL800型 （BioTek，USA）；流式细胞仪 （贝克曼CytomicsTMFC 500）；CO2培养箱（MCO-20，日本SANYO公司）；倒置显微镜（DMIL，德国Leica公司）等。

1.5模型制备在清洁级实验动物房适应性饲养小鼠5 d后，分别将各组小鼠置于密封透明容器内以乙醚吸入性麻醉，空白组每只小鼠给予50 μL 0.9%氯化钠注射液滴鼻刺激，其余各组给予RSV病毒按50 μL/只滴鼻。造模48 h后，分别予利巴韦林0.0025 g/mL（相当于小儿临床等效量），清肺口服液1.33 g/mL（相当于小儿临床等效量）和4 g/mL（相当于小儿临床3倍等效量）灌胃给药，空白组和模型组给予等剂量0.9%氯化钠注射液刺激。

1.6标本采集与检测给药24 h后处死小鼠。1）肺病理组织评分。剖取肺小叶，经4%多聚甲醛溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包理，制片，HE染色，由病理专业人员在光学显微镜下200倍阅片，评分标准［6］：肺泡壁充血、水肿、炎细胞浸润各1分；肺气肿1分；肺泡腔渗出1分；肺内支气管上皮变性、腔内渗出各1分，累加所有分数，即为病理得分。2）酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠肺泡灌洗液（BALF）中IL-2和IL-17的表达。摘眼球取血后处死小鼠，剥离出气管，在环状软骨处剪一小口，插入8号灌胃器针头并固定，连接1 mL注射器，先后用预冷的PBS 0.8 mL、0.6 mL、0.5 mL冲洗小鼠肺脏，灌洗液移至5 mL离心管中，整个过程于冰上进行，将离心管置于2500 r/min离心5 min，取上清液。根据ELISA试剂盒说明书，制作标准曲线，加样，温育，洗涤后用底物显色，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD）值，计算样品浓度。3）流式细胞术检测小鼠脾脏细胞中Treg/Th17的水平。将刚摘取的小鼠脾脏加人冷的PBS研磨成为单细胞悬液，每管抽取200 μL左右；根据流式试剂盒操作流程进行染色、破膜及固定，最后上流式细胞仪检测。

1.7统计学处理应用SPSS17.0统计软件处理。正态分布数据用（±s）表示，偏态分布用中位数（四分位间距）表示。资料正态分布且方差齐时，采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法；资料偏态分布时，采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

表1　各组小鼠肺组织病理改变评分比较（分，±s）

表1　各组小鼠肺组织病理改变评分比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05。

组别　n空白组　5模型组　5清肺高剂量组　5评分0.80±0.35*5.60±0.65 4.00±0.71*清肺低剂量组　5　4.80±0.57利巴韦林组　5　3.30±0.76*

2.1各组小鼠肺组织病理改变见表1。空白组小鼠肺组织未见异常变化；模型组小鼠肺组织出现肺泡壁中度充血、水肿，致肺泡壁增厚，肺内支气管上皮变性；利巴韦林组小鼠肺内支气管上皮细胞排列较整齐，腔内无明显炎性渗出物；清肺低剂量组小鼠肺组织出现少量中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润；清肺高剂量小鼠肺组织未见明显细胞坏死，管腔内未见渗出物，支气管周围无明显水肿或炎细胞浸润（见图1）。与空白组比较，模型组肺组织病理评分增高 （P<0.01）；与模型组比较，利巴韦林组、清肺高剂量组肺组织病理评分降低（P<0.05）。

图1　各组小鼠组织病理改图片结果（HE染色，×200）

2.2各组小鼠BALF中IL-2、IL-17表达水平的比较如表2。空白组与模型组相比，两者之间IL-2和IL-17的差异具有统计学意义（P<0.01），各给药组与模型组相比，清肺高、低剂量组，利巴韦林组作用于小鼠RSV肺炎可升高IL-2的水平（P<0.01），并降低IL-17的表达水平（P<0.01）。

表2　各组小鼠BALF中IL-2、IL-17表达水平比较（±s）

表2　各组小鼠BALF中IL-2、IL-17表达水平比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与利巴韦林组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组　别　n　IL-2（ng/L）　IL-17（pg/mL）空白组　5　60.11±1.07**　8.72±0.64**模型组　5　28.08±2.07　70.49±0.40清肺高剂量组　5　45.38±1.87**△△　30.96±1.02**△△清肺低剂量组　5　35.2±1.22**△△　55.89±0.72**△△利巴韦林组　5　33.43±0.49**　42.06±0.86**

2.3各组小鼠脾脏细胞中Treg/Th17水平的比较见表3。空白组与模型组相比，Treg/Th17的差异具有统计学意义（P<0.01），各给药组与模型组相比，清肺口服液高、低剂量组作用于RSV肺炎小鼠后可上调Treg 及Treg/Th17的水平，下调Th17。

表3　各组小鼠脾脏细胞中Treg、Th17表达水平及Treg/Th17比值比较（±s）

表3　各组小鼠脾脏细胞中Treg、Th17表达水平及Treg/Th17比值比较（±s）

组　别　n　Treg空白组　4　4.70±0.39**模型组　4　2.41±0.49清肺高剂量组　4　4.70±0.84**△△清肺低剂量组　4　3.43±0.30*利巴韦林组　4　4.86±0.80**Th17　Treg/Th17 1.37±0.29**　3.52（1.61）**5.26±1.15　0.42（0.20）0.87±0.05**△△5.09（2.36）**△1.76±0.18*△△1.98（0.25）*△△1.23±0.07**　4.03（1.42）**

3　讨　论

RSV感染引起的RSV肺炎是引起婴幼儿下呼吸道感染最常见的原因［7］。患病时年龄越小，RSV病毒载量越高，其病情越重，住院时间及临床症状持续的时间越长［8-9］。婴儿时期有严重RSV肺炎病史的儿童，以后发展成为哮喘等过敏性疾病的几率增加［10］，并可能影响其免疫系统的发育［11］。西医尚无有效的防治方法，中医药清热解毒、活血化瘀、化痰止咳等方法，在抗病毒、缩短病程、改善症状等方面具有一定的优势［12-13］。清肺口服液具有开肺化痰，解毒活血之功效，在治疗RSV肺炎痰热闭肺证中取得了良好的效果［5］，但中药复方抗RSV的机理尚未完全揭示，其与免疫学、分子细胞生物学方面的结合有待进一步研究。

RSV感染可以上调Th17细胞，下调Treg细胞［14］。Th17在炎症反应中发挥着重要的作用，其分泌的IL-17具有促炎作用［15］。而Treg在防止RSV病毒引起的免疫损伤方面具有重要的作用，其可以抑制炎症反应［16］。研究表明，Treg细胞可以通过下调抗病毒的T细胞的反应性来减轻由于病毒高复制引起的免疫损伤［17］。IL-2是调控免疫应答的重要因子，可以抑制CD4+T淋巴细胞向Th17细胞的分化，促进Treg细胞的增加［18］，并与某些自身免疫疾病的产生有关［19］。IL-2连续10 d用于正常的小鼠，可以使血中的Treg增加至2倍［20］，结核杆菌感染的早期应用IL-2治疗，可以同时使血液和肺间隔的Treg细胞增多，减轻肺结核患者肺部的炎症和损伤［21］。IL-2具有抑制Th17细胞和IL-17产生的作用，研究显示，敲除IL-2基因可使小鼠血清中IL-17及Th17细胞的水平升高［22］。IL-17可通过直接抑制T-bet、IFN-γ等的活性发挥促炎作用，严重的RSV感染的婴幼儿其呼吸道分泌物中IL-17的水平升高，敲除IL-17基因或给予抗IL-17治疗可使RSV感染小鼠的呼吸道黏液分泌明显减少，炎症减轻，病毒载量下降，同时IL-17还参与了RSV相关的过敏性的呼吸道疾病［23］。转化生长因子-β（TGF-β）由Treg细胞分泌，是调节组织炎症和修复的重要细胞因子，其与促炎因子结合可以影响Th17和Treg的水平。TGF-β在低浓度时与IL-6和IL-21协同促进IL-23R的表达，从而上调Th17，高浓度时则抑制IL-23R的表达，从而上调Treg。Foxp3和RORγt分别为Treg和Th17的转录因子，在体内TGF-β可以促使Foxp3抑制RORγt的功能从而下调 Th17；IL-6，IL-21和 IL-23可以降低Foxp3对RORγt的抑制，上调Th17细胞，因此，Th17 和Treg细胞的平衡依赖于多种细胞因子的调节，失去Treg的作用，Th17细胞会失去抑制而异常升高［24］，从而发生严重的炎症反应。

本次实验研究结果显示，模型组小鼠肺泡壁明显增厚，中度充血及肺间质炎症细胞浸润，给药组小鼠肺组织病变程度较模型组减轻，肺部无明显充血及炎性渗出物。与模型组相比，清肺口服液及利巴韦林颗粒作用于RSV肺炎小鼠后可使BALF中IL-2的水平升高，IL-17的水平降低，同时可以上调Treg，下调Th17，使Treg/Th17的水平升高，表明清肺口服液可以通过上调Treg/Th17及IL-2的水平，降低IL-17的水平而发挥抗病毒、开肺化痰、解毒活血之功效。与利巴韦林组相比，清肺高剂量组的Treg/Th17及IL-2的水平升高，IL-17的水平降低，清肺低剂量组的Treg/Th17的水平下降，IL-2及IL-17的水平升高，表明清肺口服液高剂量组的作用优于利巴韦林组，但清肺口服液低剂量组在升高Treg/Th17及降低IL-17水平方面劣于利巴韦林组，由此可知清肺口服液治疗RSV肺炎具有剂量依赖性，剂量越高，效果越好，适当增加剂量，其治疗RSV肺炎的作用可优于利巴韦林。中医中药在治疗RSV肺炎中具有较好的应用前景，本实验不仅证实了清肺口服液治疗RSV肺炎的有效性，也为探讨其发病机制提供了思路。

［1］Everard ML.The role of the respiratory syncytial virus in airway syndromes in childhood［J］.Current Allergy and Asthma Reports，2006，6（2）：97-102.

［2］Lozano R，Naghavi M，Foremanet K，et al.Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010：a systematic analysis for the global burden of sisease atudy 2010［J］.The Lancet，2012，380（9859）：2095-2128.

［3］K Thorburn，S Kerr，N Taylor，et al.RSV outbreak in a paediatric intensive care unit［J］.Journal of Hospital Infection，2004，57（3）：194-201.

［4］张程，袁斌，徐建亚，等.清肺口服液对RSV肺炎患儿血清中IL-6及TNF-α表达水平的影响［J］.中国中医急症，2012，21（8）：1216-1217.

［5］袁斌，任现志，孙轶秋，等.清肺口服液治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎166例多中心单盲对照临床观察［J］.中医杂志，2009，50（3）：221-223.

［6］Martin RJ，Chu HW，honour JM，et al.Airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness after Mycoplasma pneumoniae infection in a murine model［J］.J Am J Reapir Cell Mol Biol，2001，24（5）：577-582.

［7］ Drago L，Nicola L，Ossola F，et al.In vitro antiviral activity of resveratrol against respiratory viruses［J］.Journal of Chemotherapy，2008，20（3）：393-394.

［8］ Lili Zhou，Qiuyan Xiao.The impact of viral dynamics on the clinical severity of infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis［J］.J Med Virol，2015，87（8）：1276-1284.

［9］Shaw KN，Bell LM，Sherman NH，et al.Outpatient assessment of infants with bronchiolitis［J］.American journal of diseases of children，1991，145（2）：151-155.

［10］Sigurs N，Aljassim F，Kjellman B，et al.Asthma and allergy patterns over 18 years after severe RSV bronchiolitis in the first year of life［J］.Thorax，2011，65（12）：1045-1052.

［11］Tregoning JS，Schwarze J.Respiratory viral infections in infants：causes，clinicalsymptoms，virology，andimmunology［J］. Clinical Microbiology Reviews，2010，23（1）：74-98.

［12］徐玲，李志山，桂玉平，等.清肺口服液治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎痰热闭肺证临床研究［J］.山东中医杂志，2008，27（10）：660-662.

［13］吕旭潇，崔清华，何军，等.小儿双金清热口服液对RSV病毒感染小鼠血清炎症因子的影响［J］.山东中医药大学学报，2015，39（5）：456-457.

［14］Qin L，Hu CP，Feng JT，et al.Activation of lymphocytes induced by bronchial epithelial cells with prolonged RSV infection［J］.PLoS ONE，2011，6（12）：e27113.

［15］Yu Raymond Y，Gallagher Grantl.A naturally occurring，soluble antagonist of human IL-23 inhibits the development and in vitro function of human Th17 cells［J］.Journal of Immunology，2010，185（12）：7302-7308.

［16］Fulton RB，Meyerholz DK，Varga SM.Foxp3+CD4 regulatory T cells limit pulmonary immunopathology by modulating the CD8 T cell response during respiratory syncytial virus infection［J］.J Immunol，2010，185（4）：2382-2392.

［17］Schmitz I，Schneider C，Frihlich A，et al.IL-21 restricts virus-driven Treg Cell expansion in chronic LCMV infection［J］.PLoS Pathog，2013，9（5）：e1003362.

［18］Laurence Arian，Tato Cristina M，Davidson Todd S，et al.Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation［J］.Immunity，2007，26（3）：371-381.

［19］Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，et al.Foxp3+CD25+CD4+natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease［J］.Immunol Rev，2006，212（1）：8-27.

［20］González FB，Villar SR，Bussy RF，et al.Immunoendocrine dysbalance during uncontrolled T.cruzi infection is associated with the acquisition of a Th-1-like phenotype by Foxp3+T cells［J］.BrainBehaviorandImmunity，2015，45（3）：219-232.

［21］Chen CY，Huang D，Yao SY，et al.IL-2 simultaneously expands Foxp3+T regulatory and T effector cells and confers resistance to Severe Tuberculosis（TB）：implicative Treg-T effector cooperation in immunity to TB［J］.Journal of Immunology，2012，188（9）：4278-4288.

［22］JS Stumhofer，J Silver，CA Hunter，et al.Negative regulation of Th17 responses［J］.Seminars in Immunology，2007，19（6）：394-399.

［23］Mukherjee S，Lindell DM.IL-17-induced pulmonary pathogenesis during respiratory viral infection and exacerbation of allergic disease［J］.Am J Pathol，2011，179（1）：248-258.

［24］Chaudhry A，Rudra D，Treuting P，et al.CD4+regulatory T cells control TH17 responses in a Stat3-dependent manner［J］. Science，2009，326（5955）：986-991.

（收入日期2016-02-25）

The Effects of Qingfei Oral Liquid on Expression of Treg/Th17，IL-2 and IL-17 in RSV Infected Mice

HU Chanchan，YUAN Bin，ZHOU Lihua，et al.The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210029，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）06-0941-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.001

国家自然科学基金资助项目（81574025）；江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室开放课题（JKLPRD201410）

△（电子邮箱：yuanbin68358@163.com）