溪黄草抗乙型肝炎病毒体外抑制作用研究

庞琼，胡志立（.郴州市疾病预防控制中心体检科，湖南423000；2.湘南学院胃肠外科，湖南郴州423000）

·论著·

溪黄草抗乙型肝炎病毒体外抑制作用研究

庞琼1，胡志立2△
（1.郴州市疾病预防控制中心体检科，湖南423000；2.湘南学院胃肠外科，湖南郴州423000）

目的为证实溪黄草单味药具有体外抗乙型肝炎病毒活性提供重要的科学依据。方法将溪黄草50%乙醇提取物配置成一定药物浓度，拟采用HepG2.2.15细胞模型进行细胞毒试验和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）酶联免疫检测。结果半数细胞抑制时其浓度为4.275mg/mL，溪黄草粗提物对HBsAg的半抑制浓度（IC50）为2.250mg/mL，对HBeAg的IC50为2.150mg/mL，治疗指数小于2。结论溪黄草粗提物具有抑制体外乙型肝炎病毒的作用。

溪黄草；肝炎病毒，乙型；细胞培养技术；植物，药用；细胞毒性试验，免疫

【Abstract】Objective To provide an important scientific basis for verifying the in vitro anti-HBV activity of single herb Rabdosia Serra.M ethods 50% ethanolextract of Rabdosia Serra was dispensed ascertain concentrations.The HepG 2.2.15 cellularmodel was adopted to conduct the cellular toxicity testand HBs Ag and HBe Ag enzyme-linked immunosorbentssay（ELISA）. Results IC50was 4.275mg/mL，IC50of crude extract of Rabdosia Serra on HBs Ag was 2.250mg/mL，which on HBe Ag was 2.150 mg/mL，the therapeutic index（TI）＜2.Conclusion The crude extract of Rabdosia Serra has the effect for in vitro inhibiting HBV.

【Key words】Isodon striatus；Hepatitis B virus；Cell culture techniques；Plants，medicinal；Cytotoxicity tests，immunologic

目前，乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行趋势，据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者［1］。2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国1～59岁人群乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带率为7.18%［2-3］。据此推算，我国有慢性HBV感染者约9 300万人，其中慢性CHB患者约2 000万例［4］。我国是乙型肝炎大国，因此，国家将乙型肝炎药物的研发作为重点研究项目。溪黄草属唇形科香茶菜属，多年生草本植物，香茶菜属植物在民间做药用，功效之一即为能够治疗各种肝炎。到目前为止，大多数对溪黄草的研究集中在对其化学成分的分离与鉴定上，而抗乙型肝炎的实验研究较少，对HBV的体外抑制作用的实验研究更少，且大部分是采用以溪黄草为主的复方制剂为研究对象，因此，该实验研究溪黄草单味药体外抗HBV活性部位有利于深度开发溪黄草。该研究用HepG2.2.15作为细胞模型，将溪黄草50%乙醇提取物配置成一定药物浓度，进行体外抑制HBV试验。

1　材料与方法

1.1材料溪黄草（购自长沙市中药大市场），乙醇（国产分析纯），HepG2.2.15细胞（购自中南大学细胞培养中心），RPMI1640干粉，胎牛血清，G-418（Geneticin），谷氨酰胺，青链霉素（双抗），RPMI1640培养液，噻唑蓝（MTT）反应液，细胞消化液（0.25%胰酶），HBV表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法），乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）诊断试剂盒（酶联免疫法），HBV核酸扩增（HBV PCR）荧光检测试剂盒，氨水，阿昔洛韦片（0.1 g/片）；CO2细胞培养箱，倒置显微镜，离心机（KA-1000型），超净工作台（YJ-875型），生化培养箱（SP-01型），艾科浦纯水机（AFX-Z-1001-P型），恒温水浴箱（HWS-26型），酶标仪，荧光定量PCR仪，培养瓶，96孔板。

1.2方法

1.2.1HepG2.2.15细胞株的培养、冻存、复苏。

1.2.2药物的配制选取溪黄草50%乙醇提取物，阿昔洛韦分别用0.1%二甲基亚砜（DMSO）溶解，配成一定浓度；5%NaHCO3、1mol/LHCl调pH值至6.8～7.2，0.25μm针头过滤器过滤后备用。

1.2.3细胞毒性测定HepG2.2.15细胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化成单个细胞，吹打均匀后接种于96孔板，每孔细胞数2×104个，37℃，5%CO2孵箱培养24 h，待细胞贴壁后加含不同浓度药物的培养液。溪黄草提取物3 g，用100mL的0.1%DMSO稀释成30mg/mL制成储备液，再用0.1%DMSO稀释成2.5、3.5、4.0、4.5、5.0mg/mL 5个浓度，每孔20μL加于96孔板，每浓度4孔，分别在3、6、9 d换同浓度药液，设无药物细胞对照组和培养液空白对照组及阿昔洛韦阳性对照组，作用9 d后显微镜下观察细胞生长状态。吸取上清用于抗原检测，每孔加入100μL培养液，加入10μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝（MTT）；在37℃，5%CO2培养箱内培养4 h，可见紫黑色颗粒，弃去培养液及MTT液，每孔加入DMSO 150μL，振荡后颗粒溶解，用酶联免疫检测仪测450 nm光密度（OD）值OD450。

1.2.4对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg合成分泌的抑制实验用0.1%DMSO稀释成0.3、0.8、1.0、2.0、2.5mg/mL 5个浓度，设无药物细胞对照组和培养液空白对照组，阿昔洛韦阳性对照组，作用9 d后检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg抗原含量。每孔加入待测标本（即上清培养液）50μL，再将每孔中加入酶结合物50μL（空白对照组除外），充分混匀后封板，置37℃孵育8 h。手工洗板，弃去孔内液体，洗涤液储满各孔，静置5 s后甩干，重复5次后拍干。每孔加入显色板A、B液各50μL，充分混匀，封板，置37℃孵育15min。最后，每孔加入终止液50μL，混匀。用酶标仪测定，先用空白孔校零，然后读取450 nm处各孔OD值。当日不进行测定的细胞培养上清，需放置在-20℃保存。

1.2.5对HepG2.2.15细胞HBV DNA合成分泌的抑制实验对抗原检测确实有效的药物，留存细胞培养上清。采用HBVPCR荧光检测试剂盒，检测细胞培养上清中HBV DNA含量。具体操作，取9 d的上清合并液加等量DNA提取液打匀，沸水浴10 min（误差不超过1min），转至4℃静置8～12 h以保证病毒颗粒充分裂解。10 000 r/min离心5min，取上清保存DNA于-20℃备用。提取上清液中的DNA加入HBVDNA PCR荧光检测试剂盒中的PCR反应管（已加入HBV DNA特异性引物、一条HBVDNA特异性荧光探针、耐热Taq DNA聚合酶、4种核苷酸单体dNTPs，PCR反应液）。用ABI7000实时定量检测。

1.3统计学处理应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1细胞毒实验结果细胞抑制百分率（%）=［（细胞对照OD450值-加药组OD450值）/（细胞对照OD450值-空白OD450）］×100%。TC50：以细胞抑制率对药物浓度用Origin软件拟合，若曲线形状为典型的S型浓度-效应曲线，可得到抑制细胞生长50%时所需药物浓度，即TC50。取储备液稀释成2.5、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL 5个浓度，作用于HepG2.2.15，MTT实验后，经计算得抑制率分别为1.0%、7.2%、21.0%、56.0%、60.3%，经Origin软件拟合，其半数细胞抑制时其浓度为4.275mg/mL，即TC50为4.275 mg/mL，阳性对照组的TC50为0.370mg/mL。

2.2抗原分泌抑制实验结果抗原抑制率（%）=［（细胞对照OD450-加药组OD450值）/（细胞对照组OD450-空白OD450）］×100%。将药物浓度与抑制率输入软件，通过量效关系来拟合曲线，从而推算出半抑制浓度（IC50），即半数有效浓度，也是抑制抗原分泌达50%时所需的药物浓度。溪黄草50%提取物有抗HBV活性。在无毒浓度2.5 mg/mL时对HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制率为51.8%；对HBeAg的抑制率为53.4%。经Origin软件S曲线拟合，溪黄草粗提物对HBsAg的IC50为2.25mg/mL，对HBeAg的IC50为2.15mg/mL。见表1、2。

表1　溪黄草50%乙醇提取物对HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制情况

表2　溪黄草50%乙醇提取物对HepG2.2.15分泌HBeAg的抑制作用

2.3TI TI=TC50/IC50当TI＜1.0表明受试样品为无效；1～2为低效有毒，即弱阳性；＞2～＜10为有效低毒，即阳性；≥10为高效低毒，即强阳性。根据细胞毒实验，及体外乙型肝炎抗原分泌抑制实验，计算得到溪黄草50%提取物对HBsAg的治疗指数为1.90；对HBeAg的治疗指数为1.99。因此，为有效低毒。阳性对照组HBeAg的IC50为7.750mg/mL，TI为0.048＜2；HBsAg的IC50为0.001 mg/mL，TI为328.472＞2。

2.4对HepG2.2.15细胞合成HBVDNA作用结果为进一步确证溪黄草50%提取物的抗病毒作用，采用荧光定量PCR方法检测细胞培养上清中HBV DNA含量。即浓度为0mg/mL，DNA拷贝数为280×103；浓度为0.5mg/mL，DNA拷贝数为190×103；浓度为1.0mg/mL，DNA拷贝数为96×103；浓度为2.0mg/mL，DNA拷贝数为57×103；浓度为2.5mg/mL，DNA拷贝数为22×103。

溪黄草粗提物对HepG2.2.15细胞分泌HBV DNA有抑制作用，且随浓度的增加，细胞培养上清中HBVDNA含量减少，呈剂量依赖关系，见图1。溪黄草50%提取物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且呈剂量-效应依赖关系。阳性对照组仅对HBsAg有抑制作用。从以上抑制抗原及HBV DNA的实验可以看出，溪黄草50%乙醇提取物具有抗HBV的活性，因此，可将溪黄草50%乙醇的提取物继续进行下一步的分离。3讨论

图1　溪黄草95%提取物抑制HBVDNA分泌活性检测情况

目前治疗HBV以干扰素及核苷类似物为主，而其均具有一定的使用局限性。比如干扰素-α（INF-α），来源于宿主细胞对病毒发生免疫应答而产生的蛋白质，既有免疫调节作用，又有抗病毒的作用。但由于其不良反应明显，可加重某些免疫性疾病，而且高病毒载量者应答率低，因此，INF-α的使用受到一定的限制［5］。

我国天然植物资源丰富，从中找到了抗HBV的天然有效成分，具有极其重要的社会意义和经济意义。目前已研制出以溪黄草为组方的保健产品，溪黄草茶已在市场上广泛应用［6］。临床上已将溪黄草用于治疗HBV，例如使用新鲜溪黄草汁（溪黄草I.Prrd）加蜜糖口服，治疗临床诊断的HBV［7］，采用自拟蛇参虎溪汤治疗HBV，总有效率达83.8%［8］。还有研究者做过溪黄草的复方制剂对HBV的体外抑制作用，发现十味溪黄草颗粒在HepG2.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的分泌有显著的抑制作用［9］。由此看来，从民间药用到临床使用再到药物实验室基础研究，都为溪黄草抗HBV作用提供了初步证据。本研究将单味溪黄草药物作为研究对象，进行抗HBV体外抑制研究，具有新的研究价值，为开发中草药治疗HBV提供科研依据。

血清HBsAg定量检测可用于预测疾病进展、抗病毒疗效和预后［10-11］。因此，本研究选取了HBsAg、HBeAg进行酶联免疫检测。而HBVDNA定量检测主要用于判断慢性HBV感染的病毒复制水平，可用于抗病毒治疗适应证的选择及疗效的判断。因此，本实验采用灵敏度和精确度高的PC R法来测定HBV DNA。

虽然本研究证实了单味溪黄草具有体外抗HBV的作用，但药物进入体内后，要进行复杂的代谢，产生一些新的有效成分，也可能有些有效成分会被灭活，或体内、体外有效的药物浓度会存在较大差距，为进一步验证溪黄草抗HBV的作用，下一步还应当进行体内实验。

综上所述，溪黄草50%乙醇提取物具有体外抗HBV的活性，因此，可将溪黄草50%乙醇的提取物继续进行下一步的分离，为筛选溪黄草体外抗HBV活性部位提供素材。

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Study on in vitro inhibiting effect of Rabdosia Serra in anti-HBV

Pang Qiong1，Hu Zhili2△
（1.Chenzhou Municipal Center

for Disease Control and Prevention，Chenzhou，Hunan 423000，China；2.Department of Gastroent erological Surgery，Affiliated Hospitalof Xiangnan College，Chenzhou，Hunan 423000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.010

A

1009-5519（2016）10-1465-03

庞琼（1981-），硕士研究生，主治医师，主要从事临床及相关基础研究工作。

△，E-mail：50381234@qq.com。

（2016-02-18）