佛手叶挥发油诱导HeLa细胞凋亡与坏死*1

陈　佳，　邵邻相，　麻艳芳，　张璐敏，　曾　杰

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华　321004）

佛手叶挥发油诱导HeLa细胞凋亡与坏死*1

陈佳，邵邻相，麻艳芳，张璐敏，曾杰

（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）

研究了佛手叶挥发油对HeLa细胞凋亡与坏死的影响.用单细胞凝胶电泳、DNA梯度电泳检测DNA损伤，流式细胞术检测细胞周期和DNA含量的变化，Western Blot检测凋亡相关蛋白PARP的表达.结果显示：200μg/m L佛手叶挥发油处理HeLa细胞，彗星头缩小，荧光强度减弱且染色不均匀，出现彗尾，G2/M期细胞数量增加，PARP蛋白几乎全部被切割；400μg/mL佛手叶挥发油处理HeLa细胞，DNA梯度条带明显，表明大多数细胞处于晚期凋亡阶段；800μg/mL佛手叶挥发油处理HeLa细胞，无大分子条带，DNA完全断裂.表明200μg/mL和400μg/mL佛手叶挥发油可诱导HeLa细胞凋亡，800μg/mL佛手叶挥发油诱导HeLa细胞坏死.

佛手叶；挥发油；HeLa细胞；凋亡；坏死

佛手为芸香科柑桔属，具有止咳化痰、疏肝理气、和胃止痛的功效，是我国重要的抗肿瘤中药［1］.近年来，佛手挥发油的抗菌消炎作用被广泛关注.王建英等［2］研究发现，佛手挥发油具有抗炎消肿的功效.郭卫东等［3］研究表明，佛手挥发油能有效抑制枯草杆菌、大肠杆菌等的增殖.本实验室前期研究表明，佛手挥发油可有效抑制体外培养的MDA-MB-435人乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡［4］.但目前有关佛手叶挥发油抗肿瘤方面的研究较少.魏玉君等［5］研究发现，佛手叶挥发油对Hep3B等6种癌细胞的增殖具有明显的抑制作用.本文着重探讨了佛手叶挥发油对HeLa细胞凋亡与坏死的影响，为开发治疗肿瘤的天然药物提供实验依据.

1　材料与方法

1.1佛手叶挥发油的制备

实验方法参照文献［6］.

1.2主要试剂与仪器

DMEM培养基、胰蛋白酶为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；溴化乙锭（EB）购于Sigma公司；Caspase-3抗体、PARP抗体、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗均购自Santa Cruz公司.DNA Ladder试剂盒和ECL试剂盒均购于碧云天生物技术有限公司.

1.3细胞培养和细胞活力检测

实验方法参照文献［6］.应用SPSS 19.0软件计算IC50值，进行细胞活力检测.

1.4单细胞凝胶电泳检测DNA损伤

佛手叶挥发油处理HeLa细胞6 h，收集细胞.实验方法参照文献［7］.

1.5DNA梯度电泳检测DNA断裂

佛手叶挥发油处理HeLa细胞24 h，收集细胞.DNA Ladder试剂盒提取DNA，电泳，拍照.

1.6流式细胞术检测细胞凋亡

佛手叶挥发油处理HeLa细胞6 h，收集细胞，预冷的无水乙醇4℃固定过夜，PI（碘化丙啶）染色.流式细胞仪检测，CELL Quest软件进行结果分析.

例如，教学《营养要均衡》一课时，以学校中学生身体状况问卷为基础，分析描述大部分同学的胖瘦除了遗传因素以外，饮食是一个重要的因素。教师可要求学生对照均衡膳食“宝塔”并根据自身的实际情况制定相应的“生活作息表”或者“健康食谱”，选择食物均衡身体所需要的营养。并严格督促学生将自己所制定的健康目标运用到自身实践之中，这样不仅能培养学生良好的生活习惯，还能促使学生课外活动以及生活方式都朝着良性健康的方式转变。

1.7Western Blot检测蛋白表达

佛手叶挥发油处理24 h，收集细胞，提取总蛋白.SDS（十二烷基硫酸钠）-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳，转膜，封闭.一抗、二抗孵育.ECL试剂盒发光，X-光片曝光，显影，定影，拍照.

1.8统计分析

应用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，以P＜0.05为统计学显著性差异.

图1　单细胞凝胶电泳检测佛手叶挥发油对HeLa细胞DNA损伤的影响

2　结果

2.1佛手叶挥发油对HeLa细胞活力的影响

佛手叶挥发油处理HeLa细胞，细胞活力明显降低.不同剂量的佛手叶挥发油（31.25，62.50，125.00，250.00，500.00和1 000.00μg/mL）分别处理HeLa细胞6，12和24 h的IC50值依次为146.50，145.84和101.39μg/mL.增殖抑制率随药物作用时间的延长和药物浓度的增加而增大.

2.2佛手叶挥发油对HeLa细胞DNA损伤的影响

由图1可见：对照组细胞DNA未损伤，彗星头为光滑圆形，荧光强度较强，颜色均一；200 μg/mL佛手叶挥发油处理HeLa细胞，彗星头明显缩小，荧光强度较弱，染色不均一，出现彗尾，表明DNA已损伤.

2.3佛手叶挥发油对HeLa细胞DNA断裂的影响

由图2可见：与对照组相比，不同剂量的佛手叶挥发油处理HeLa细胞均出现DNA梯度条带；400μg/mL佛手叶挥发油处理后条带最明显，表明多数细胞发生晚期细胞凋亡；200μg/mL佛手叶挥发油处理后条带较弱，表明多数细胞处于中期凋亡阶段，少数细胞进入晚期凋亡阶段；800 μg/mL佛手叶挥发油使大多数HeLa细胞坏死.

2.4流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡

由图3可见：对照组细胞存在二倍体和四倍体峰，细胞周期正常；与对照组相比，200μg/mL佛手叶挥发油处理HeLa细胞，G0/G1期细胞数量减少，G2/M期细胞数量增加.表明佛手叶挥发油将细胞周期停滞于G2/M期，从而诱导细胞凋亡.

图2　DNA梯度电泳检测佛手叶挥发油对HeLa细胞DNA断裂的影响

图3　流式细胞仪检测佛手叶挥发油对HeLa细胞凋亡的影响

图4　佛手叶挥发油对HeLa细胞凋亡相关蛋白PARP表达的影响

2.5Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达

由图4可见：对照组和阴性对照组，PARP蛋白以116 kDa的形式存在；5-氟尿嘧啶组和200 μg/mL佛手叶挥发油处理HeLa细胞，PARP蛋白几乎完全被切割成89 kDa；400μg/mL佛手叶挥发油处理HeLa细胞，PARP蛋白部分被切割成89 kDa.PARP蛋白的切割失活依赖于Caspase-3的激活.由此表明，佛手叶挥发油诱导HeLa细胞凋亡可能依赖于Caspase介导的PARP途径.

3　讨论

细胞死亡的2种主要方式为细胞凋亡和细胞坏死.多聚ADP核糖聚合酶（PARP）是一种非组蛋白染色体蛋白质，具有保持染色体结构完整的功能，在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发挥重要的作用.研究表明，当 DNA受损断裂时，PARP被激活，作为DNA损伤的分子感受器先占据DNA缺口位点，保护裸露的DNA末端免遭核酸酶水解，此外还引导DNA修复酶与缺口接触，进行修复［8］.PARP是凋亡过程中Caspase-3和其他半胱氨酸蛋白酶降解的底物，被认为是细胞凋亡的一个早期分子标志.Caspase-3将PARP剪切成24 kD和89 kD两种片段，继而PARP的聚ADP和核糖化作用丧失，导致PARP失活，降解核小体DNA，引起凋亡.大量的研究表明，通过刺激Caspase家族激活，从而裂解其底物PARP，导致细胞凋亡［9-10］.

本实验研究发现，佛手叶挥发油处理HeLa细胞，PARP切割失活.彗星电泳出现拖尾现象，DNA Ladder梯度条带明显.这与张璐敏等［7］研究野艾蒿挥发油处理HeLa细胞后的实验结果相类似.表明佛手叶挥发油诱导HeLa细胞凋亡的机制可能是依赖Caspase介导的PARP凋亡信号转导途径.本实验中，高剂量（800μg/mL）佛手叶挥发油处理HeLa细胞，由于大量蛋白质外泄，很难从培养基中提取出相关蛋白，因而在Western Blot中未检测到β-actin和PARP蛋白条带.

综上所述，低剂量（200μg/mL）和中剂量（400μg/mL）佛手叶挥发油诱导HeLa细胞凋亡；高剂量（800μg/mL）佛手叶挥发油诱导HeLa细胞坏死.

［1］农东红，刘威，韦艳梅，等.不同种质佛手五种微量元素含量的比较分析［J］.北方园艺，2012（21）：165-166.

［2］王建英，施长春，朱婉萍，等.金华佛手挥发油抗炎及急性毒性的实验研究［J］.现代中药研究与实践，2004，18（2）：46-48.

［3］郭卫东，郑建树，邓刚，等.佛手挥发油抑菌活性的研究［J］.中国粮油学报，2009（8）：103-107.

［4］麻艳芳，邵邻相，张均平，等.佛手挥发油对MDA-MB-435人乳腺癌细胞体外增殖的影响［J］.中国药学杂志，2010（22）：1737-1741.

［5］魏玉君，邵邻相，麻艳芳，等.佛手叶挥发油的成分分析及生物活性研究［J］.浙江师范大学学报：自然科学版，2014，37（3）：329-333.

［6］成文召，麻艳芳，邵邻相，等.佛手叶挥发油对HeLa细胞形态与结构的影响［J］.浙江师范大学学报：自然科学版，2013，36（3）：331-336.

［7］张璐敏，吕学维，邵邻相，等.野艾蒿挥发油诱导HeLa细胞凋亡与坏死［J］.中药材，2013（12）：1988-1992.

［8］王淑荣，申存周.ATP，PARP，Caspase-3与细胞凋亡和胀亡［J］.中国微循环，2009，13（6）：638-640.

［9］Benchoua A，Couriaud C，Guegan C，etal.Active caspase-8 translocates into the nucleus of apoptotic cells to inactivate poly（ADP-ribose）polymerase-2［J］.JBiol Chem，2002，277（37）：34217-34222.

［10］Guégan C，Sola B.Early and sequential recruitment of apoptotic effectors after focal permanent ischemia in mice［J］.Brain Research，2000，856（1/2）：93-100.

（责任编辑薛荣）

Essential oil from fingered citron leaves induces apoptosis or necrosis of HeLa cells

CHEN Jia， SHAO Linxiang， MA Yanfang， ZHANG Lumin， ZENG Jie
（College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China）

Effects of essential oil from fingered citron leaves on apoptosis or necrosis of HeLa cellswere investigated.DNA damagewas detected by single cell gel electrophoresis and DNA agarose gel electrophoresis，cell cycle and DNA content changes were analyzed by flow cytometry assay，the expression of protein PARP was examined by Western Blot analysis.The results revealed that treated with 200μg/mL essential oil from fingered citron leaves，a comet featurewas showed with a very small head and awide tail，the fluorescence intensity reduced with uneven dying，the quantity of G2/M period cells increased，the cleavage of PARPwas inactived.The DNA-Ladder stripe was the brightest which indicated the high percentage of apoptosis occured in 400μg/mL group.There was no obvious stripe in 800μg/mL group as DNA was badly damaged.The results showed that low dose（200μg/mL）and middle dose（400μg/mL）essential oil from fingered citron leaves could induce apoptosis.However，high dose（800μg/mL）essential oil from fingered citron leaves led to necrosis of HeLa cells.

fingered citron leaves；essential oil；HeLa cells；apoptosis；necrosis

R285

A

1001-5051（2016）02-0215-04

10.16218/j.issn.1001-5051.2016.02.015

*收文日期：2015-04-27；2015-09-17

浙江省科技厅项目（2008C22023）

陈佳（1991-），女，浙江衢州人，硕士研究生.研究方向：细胞生物学.

邵邻相.E-mail：shaolinxiang@zjnu.cn