水飞蓟宾抑制缺氧状态下胃癌细胞系MGC803增殖的分子机制

伍友兴，桂若虎，郑新平，王晓洋衡阳市中心医院消化内科，湖南衡阳 421001

水飞蓟宾抑制缺氧状态下胃癌细胞系MGC803增殖的分子机制

伍友兴，桂若虎，郑新平，王晓洋
衡阳市中心医院消化内科，湖南衡阳 421001

目的探讨水飞蓟宾抑制缺氧状态下胃癌细胞MGC803细胞的生长增殖的分子机制。方法 体外缺氧条件下体外培养胃癌细胞系MGC803，用不同浓度水飞蓟宾处理后，采用MTT检测水飞蓟宾对MGC803细胞增殖的影响，Western blot检测Akt的磷酸化。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）的分泌情况。结果0～250 μmol/L蓟宾可显著抑制胃癌细胞MGC803增殖，但0～100 μmol/L水飞蓟宾对Akt磷酸化以及VEGF分泌无明显影响，而250μmol/L水飞蓟宾可诱导MGC803细胞磷酸化并抑制VEGF分泌。结论水飞蓟宾可能通过影响PI3K/Akt磷酸化以及VEGF的分泌而发挥抗肿瘤活性。

水飞蓟宾；胃癌；血管内皮生长因子

［Abstract］Objective To observe the molecular mechanism of stomach cancer cell line MGC803 proliferation in the state of hypoxia ihibited by silibinin.Methods Stomach cancer cell line MGC803 was cultured in vitro in the condition of hypoxia in vitro，the effect of silibinin on MGC803 proliferation was detected by MTT after different concentrations of silibinin treatment，the phosphorylation of Akt was detected by Western blot，the secretion situations of vascular endothelial growth factors were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results 0-250μmol/L silibinin could obviously inhibit stomach cancer cell line MGC803 proliferation，but 0-100μmol/L silibinin had no obvious effect on phosphorylation of Akt and VEGF secretion，and 250μmol/L silibinin could induce the phosphorylation of MGC803 cells and inhibit VEGF secretion.Conclusion Silibinin may exert its anti-tumor activity by influencing the phosphorylation of PI3K/Akt and VEGF secretion.

［Key words］Silibinin；Stomach cancer；Vascular endothelial growth factor

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。尽管早期根治性手术是胃癌最有效的治疗方法，但对于转移患者而言，化疗依然发挥重要的作用［1］。随着对胃癌分子生物学研究的深入，目前通过对其生长增殖的相关信号转导通路进行干预，是近年研究的热点。研究表明，某些中医药在治疗肿瘤方面具有广泛的应用前景［2-3］。水飞蓟宾（Silibinin）是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取出来的一种黄酮类化合物，临床上常用来治疗一些肝脏疾病［4-5］。水飞蓟宾毒性低。体外研究以及动物实验研究显示水飞蓟宾对多种肿瘤细胞具有较强的拮抗以及化学预防效应，并能影响多重信号通路的激活［6-7］。然而，水飞蓟宾是否也能通过影响缺氧状态下胃癌细胞增殖的机制目前尚不清楚。该研究旨在初步观察水飞蓟宾对胃癌细胞系MGC803增殖的影响及其分子机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

DMEM培养基和胎牛血清购自Hyclone（Invitrogen，USA），水飞蓟宾（纯度98%）、抗磷酸化以及抗total-Akt购自Cell Signaling（Beverly，MA）。蛋白酶抑制剂购自Roche（Mannheim，Germany），细胞总蛋白提取试剂盒购自Novagen（Gibbstown，NJ），血管内皮生长因子（VEGF）ELISA检测试剂盒购自美国Pierce（IL，USA）。

1.2 细胞培养与处理

人胃癌细胞系MGC803（ATCC）用含10%胎牛血清（Invitrogen，USA）、1%青霉素和链霉素（St.Louis，MO）的DMEM培养基中，于37℃，5%CO2浓度下培养。待培养的细胞密度达到1×106时调整血清浓度为3%，随后将培养板置于O2调节器中（COY Labs），根据氧浓度测定仪上显示值，调整充入气体气流量，最终使CO2和N2的比例分别为5%和95%，供不同的实验目的使用。

1.3 Western blot

收集经水飞蓟宾处理后的各组细胞，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（25 mmol/L；Tris-HCl；pH7.4，150 mmol/L NaCl，1%NP-40，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）裂解细胞。将获得的总蛋白用Bradford法于595 nm波长处测定其浓度后，取20 μg蛋白用于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，并于室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h。随后分别孵育一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL发光、显影。

1.4 血管内皮生长因子检测

把MGC803细胞接种至96孔板中，待其密度生长至80%～90%视野时，弃培养基，并加入不同浓度的水飞蓟宾作用相应时间。根据试剂盒提供的操作步骤，12 h后测量分泌至细胞外的血管内皮生长因子含量。VEGF按照试剂盒提供的双抗体夹心法进行。加入显色剂显色后，没孔加入1滴终止液，于450 nm波长处在酶标仪下获得其吸光度值，并根据绘制的标准曲线计算其浓度。

1.5 细胞增殖活性分析

采用MTT法检测细胞的增殖活性。将生长旺盛的MGC803细胞接种于96孔板中（100 μL），培养12 h后更换为无血清培养基，随后加入0～500 μmol/L的水飞蓟宾孵育72 h。终止培养前4 h每孔加入MTT溶液20 μL，轻微振荡以充分混匀培养液后，加入200 μL二甲基亚砜，快速振荡30 s后，用酶标仪（设置波长为570 nm）测定各孔的吸光度值，并计算抑制率，计算公式:实验组吸光度/对照组吸光度×100%。

1.6 统计方法

应用GraphPad Prizm 6.0软件进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，并采用单因素方差分析数据，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 水飞蓟宾抑制MGC803细胞增殖

MTT结果显示，0～50 μmol/L水飞蓟宾对细胞增殖无明显影响。当其浓度增高至100 μmol/L以上时，对MGC803细胞的抑制率具有一定的剂量依赖性（图1）。

图1 水飞蓟宾对缺氧条件下MGC803细胞增殖的影响

2.2 水飞蓟宾上调Akt磷酸化水平并

Western blot结果显示，0～100 μmol/L水飞蓟宾处理MGC803细胞后，磷酸化Akt水平无明显影响。当水飞蓟宾浓度达到250 μmol/L时，磷酸化Akt水平明显增高（图2）。

图2 水飞蓟宾对Akt磷酸化的影响

2.3 水飞蓟宾抑制缺氧条件下VEGF分泌

正常氧压条件下，MGC803细胞中VEGF水平为（463±21）pg/（ml·mg）蛋白，低氧条件下，VEGF水平显著增高，但0～100 μmol/L水飞蓟宾处理后对其分泌无明显影响，而其浓度超过250 μmol/L时，VEGF分泌水平明显降低（图3）。

图3 水飞蓟宾对缺氧条件下MGC803细胞VEGF分泌的影响

3 讨论

缺氧是几乎所有实体肿瘤在生长过程中所面临的共同微生态特征。随着肿瘤细胞的异常增值，局部血氧供应相对不足，为了适应该环境，肿瘤细胞内可活化一系列与代谢、血管发生的酶类与生长因子，从而维持肿瘤细胞的能量和血液供应。PI3K/Akt是参与肿瘤细胞生长增殖的重要激酶，与其转移、血管发生、耐药密切相关，因此任何能影响PI3K/Akt活性的方法均是胃癌治疗的重要靶点，各种抗肿瘤药物往往通过抑制PI3K/ Akt通路的活性而发挥抗肿瘤作用。有研究表明，水飞蓟宾能影响某些肿瘤细胞的PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。然而，水飞蓟宾是否也能通过影响胃癌细胞PI3K/Ak通路目前尚不清楚。而在该研究当中，发现0～100 μmol/L水飞蓟宾处理MGC803细胞后，磷酸化Akt水平无明显影响。当水飞蓟宾浓度达到250 μmol/L时，磷酸化Akt水平明显增高。Akt的激活可诱导下游mTOR磷酸化而促进肿瘤细胞的生长增殖。这种看似矛盾的现象与经典的理论不符。可能的原因是水飞蓟宾抑制mTOR后的活性后，可同时诱导Akt第473位丝氨酸磷酸化。事实上，mTOR在细胞内可形成两种复合物，包括mTOR复合物1（mTORC1）和mTOR复合物2 （mTORC2），分别参与不同的信号转导［8-9］。其中mTORC1对雷帕霉素抑制剂敏感，由mTOR，Raptor，和mLST8组成，主要通过p70S6K和4E-BP1调节核糖体装配以及蛋白的翻译。除此之外，p70S6K也能磷酸化IRS1而抑制PI3K/Akt的激活［10］。因此，水飞蓟宾有可能是在抑制mTORC1的同时，降低了p70S6K的负反馈作用而导致Akt激活。这意味着临床上采用mTOR抑制剂用于肿瘤治疗时，也有可能反馈性活化Akt而增加药物的不良反应。该研究同时也发现低氧条件下MGC803细胞内VEGF产生增高，仅当水飞蓟宾浓度达到250μmol/L时，才可显著抑制VEGF的分泌。可能的原因是VEGF可受缺氧诱导因子HIF-1α的调控。此外，PI3K/Akt也能通过诱导转录因子Sp1的磷酸化而促进VEGF表达［11］。因此，仅高浓度的水飞蓟宾才能显著抑制VEGF表达，可能是由于水飞蓟宾促进了Akt的激活，从而部分消除了对VEGF的抑制作用。这也意味着在临床治疗时，若同时给予PI3K或Akt抑制剂，可能对水飞蓟宾具有协同作用。

总之，该研究首次证实，水飞蓟宾可抑制胃癌MGC803细胞VEGF的分泌，这可能是其抑制肿瘤细胞生长增殖的重要机制，在随后的研究当中，将对水飞蓟宾影响细胞内其他信号转导通路开展进一步研究。

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Molecular Mechanism of Stomach Cancer Cell Line MGC803 Proliferation in the State of Hypoxia Inhibited by Silibinin

WU You-xing，GUI Ruo-hu，ZHENG Xin-ping，WANG Xiao-yang
Department of Gastroenterology，Hengyang Central Hospital，Hengyang，Hunan Province，421001 China

Q3

A

1674-0742（2016）04（b）-0009-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.11.009

伍友兴（1974-），男，湖南新化人，硕士生，副主任医师，主要从事消化系统肿瘤等疾病的临床诊断与防治研究。

2016-01-18）