食用菌天然复合防腐剂的研制*

冯　磊　李元敬　刘健美　佟立君

（黑龙江省林业科学院，哈尔滨　150081）

食用菌天然复合防腐剂的研制*

冯磊李元敬刘健美佟立君**

（黑龙江省林业科学院，哈尔滨150081）

以S.aureus和E.coli为指示菌，采用杯碟法考察榆耳水提液和黑木耳多糖、Nisin、壳聚糖4种天然防腐剂的抑菌能力，单因素研究结果表明，榆耳水提液、黑木耳多糖、壳聚糖对E.coli的抑菌效果强于S.aureus，而Nisin对S.aureus的抑制效果更好。正交试验结果表明，天然复合防腐剂具有更强的抑菌效果，其最优配比为：榆耳干物质含量为2%，黑木耳多糖干物质含量为1.6%，Nisin为1%，壳聚糖为0。

食用菌；榆耳水提液；黑木耳多糖；防腐剂；抑菌

食用菌不仅味道鲜美，其所含多糖等还具有抗癌、提高免疫力的功效［1］，所以深得人们喜爱。作为季节性产品，食用菌储存保鲜过程中容易受到环境影响，导致腐败变质，因此，如何延长保存期、并使其保持良好色泽及外观，是当前食用菌产业发展中亟待解决的重要问题。

天然防腐剂作为安全无毒、天然绿色的生物物质，用其替代传统的化学类防腐剂已是必然。Nisin虽是一种公认的安全天然防腐物质［2］，但因抗菌谱比较窄，使其应用受到限制［3］。而将Nisin与其他防腐剂配合使用所制备的复合生物防腐剂不仅可以弥补其缺点，而且可发挥广谱抑菌作用。鉴于目前针对食用菌的天然防腐剂研究比较少见，实际大规模生产中未见广泛应用的现状，本研究将榆耳子实体提取液、黑木耳多糖及Nisin、壳聚糖进行复配，研制出适用于食用菌保鲜的天然、安全复合防腐剂，现将有关研究结果报道如下。

1　试验材料与方法

1.1试验材料

黑木耳为黑龙江元宝2号；榆耳由黑龙江省林副特产研究所提供；壳聚糖，脱乙酰度80.0～95.0（国药试剂）；Nisin，分子量3 354.07 g/mol（伟日生物）；大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）黑龙江大学生命科学学院保存。

1.2试验方法

1.2.1天然防腐剂的原材料制备

榆耳水提液：榆耳60℃烘至恒重，准确称取200 g，10倍水浸泡24 h后开始加热，水沸后继续加热90min，之后加水搅拌，并用多层纱布过滤。将过滤物继续加水加热至沸腾，30 min后用纱布滤液。将两次滤液合并，减压过滤浓缩蒸干，获得干物质20 g，将其溶入200 mL无菌水中，即为榆耳水提液，其干物质含量为10%。

黑木耳多糖溶液：黑木耳50 g干燥（70℃，3 h）→粉碎→100目筛子过筛→粉末加水500 mL混合→超声波破碎→热水浸提1h→离心（3000 r/min，15 min）→抽滤→取上清液→减压旋蒸浓缩蒸干，获得干物质4 g，将其溶入50 mL无菌水中，即为黑木耳多糖溶液，多糖含量为8%。

壳聚糖溶液：用1%乙酸将其制备成1%、2%、3%三个浓度。

Nisin溶液：用无菌水将Nisin制备成0.5%、1%、2%三个浓度。

1.2.2试验设计

单因素试验：以S.aureus和E.coli为指示菌，按表1配制不同浓度梯度的榆耳水提液和黑木耳多糖、壳聚糖、Nisin溶液进行单因素试验，其中榆耳水提液和黑木耳多糖溶液采用原液倍比稀释的方法进行浓度梯度稀释。

表1　单因素试验浓度梯度　%

正交试验：以S.aureus和E.coli为指示菌，将榆耳水提液和黑木耳多糖、Nisin、壳聚糖溶液按正交实验因素水平进行复配，浓度组分别为（A1、A2、A3）、（B1、B2、B3）、（C1、C2、C3）、（D1、D2、D3），即榆耳提取干物质（0%、1%、2%），黑木耳多糖干物质（0%、0.8%、1.6%），Nisin（0%、1%、2%），壳聚糖（0%、1%、2%），进行4因素3水平正交试验（表2）。

单因素和正交试验方法的抑菌试验均采用杯碟法，测量抑菌圈的直径，并对比Nisin效价标准曲线计算效价［4］。

表2　正交试验因素水平表%

1.2.3Nisin效价标准曲线的绘制

将Nisin用0.02mol/L的 HCl稀释至 10-2、10-3等浓度，采用杯蝶法，测量抑菌圈的直径，利用y=a×lg（x）+b，得出a，b值，绘制Nisin标准曲线，通过计算可得出其效价。由Nisin效价标准曲线（图1）可以看出，回归方程y=6.328 9x+4.032 2，相关系数0.992 2，符合要求。

图1　Nisin标准曲线

2　结果与分析

由图2可以看出，榆耳水提液对S.aureus和E.coli均有抑制生长作用。当榆耳水提液的干物质含量从2%、5%、10%递增时，抑菌作用逐渐增强。榆耳水提液的干物质含量为2%时，其对E.coli抑菌作用已大于2%Nisin作用，效价为24 IU/mL。干物质含量为5%时，呈现较强的抑菌作用，对E.coli和S.aureus的抑菌效价分别为52 IU/mL、45 IU/mL。干物质含量达到10%时，对E.coli呈现最强的抑制效果，效价达到96 IU/mL，对S.aureus的抑菌效价68 IU/mL。表明榆耳水提液对S.aureus和E.coli均呈很好的抑菌效果，相比之下，其对E.coli抑制能力优于S.aureus。

图2　榆耳水提液对2种菌的抑菌效价

2.2不同浓度黑木耳多糖的抑菌效果

由图3可以看出，不同浓度黑木耳多糖对2种指示菌都有不同程度的抑菌作用，随着干物质含量的增加，抑菌效果明显增强。干物质含量为2%时，对E.coli起部分抑制作用，效果大于2%Nisin，抑菌效价为19 IU/mL；但对S.aureus的效果不明显，抑菌效价仅为6 IU/mL，此时2%Nisin的抑菌效价为54 IU/mL。干物质含量为8%时，对E.coli有很好的效果，抑菌效价为68 IU/mL；但对S.aureus仍不如2%Nisin。试验结果表明，黑木耳多糖对E.coli抑制能力优于S.aureus。

图3　黑木耳多糖对2种菌的抑菌效价

2.1不同浓度榆耳水提液的抑菌效果

2.3不同浓度壳聚糖的抑菌效果

由图4可以看出，这2种指示菌都受壳聚糖抑制，且随着壳聚糖含量的升高，抑制能力增强。当含量为2%时，对E.coli抑菌效价为21 IU/mL。当含量为3%时，对E.coli、S.aureus的抑菌效价分别为80 IU/mL、40 IU/mL；此时壳聚糖对E.coli的抑菌能力显著强于2%Nisin，但对S.aureus的抑菌能力仍低于2%Nisin。

图4　壳聚糖对2种菌的抑菌效价

2.4不同浓度Nisin抑菌效果

由图5可以看出，Nisin对S.aureus有较强的抑菌作用，当Nisin浓度为1%时，抑菌效价达到20 IU/mL；当 Nisin含量为 2%，抑菌效价达到54 IU/mL。Nisin对E.coli无显著抑制，且随含量升高抑制能力升高不显著。这说明Nisin对S.aureus有较强的抑制作用，对E.coli无明显抑制作用。

图5　Nisin对2种菌的抑菌效价

2.5天然复合防腐剂的优化

榆耳水提液和黑木耳多糖、壳聚糖、Nisin溶液对E.coli、S.aureus有不同的抑制效果。正交试验结果（表3～表6）表明，对S.aureus来说，从极差水平可以看出，主次因素A＞B＞D＞C，从均值上可以确定最优水平为A3B3C2D1；对E.coli来说，从极差水平可以看出，主次因素A＞D＞C＞B，从均值上可以确定最优水平为A3B3C2D1。方差分析表明，榆耳水提液影响复配液的抑菌能力作用最明显。

表3　正交复配液对S.aureus抑菌效果

表4　正交复配液对S.aureus抑菌效果方差分析

表5　正交复配液对E.coli抑菌效果

表6　正交复配液对E.coli抑菌效果方差分析

3　结论与讨论

3.1榆耳是一种具有药理作用的药用真菌，含有多种生物活性成分。刘瑞君［5］对榆耳子实体浸提液进行抑菌测定的结果显示，其对绿脓杆菌和痢疾表现出较强的抑菌活性，其次是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。崔京春［6］研究发现，榆耳发酵液对12株供试菌中的大多数菌表现出了抑菌作用，且对革兰氏阳性菌抑制作用好于E.coli等革兰氏阴性菌，对酵母无抑制效果。我们研究发现，榆耳子实体提取液抑制革兰氏阴性菌（E.coli）能力强于革兰氏阳性菌（S.aureus），这可能与抑菌物质的来源不同有关。

3.2黑木耳多糖是一种生物活性大分子，赵梦瑶等［7］研究表明，黑木耳多糖对S.aureus和E.coli抑菌效果较强，我们的研究结果与此相同。

3.3壳聚糖已被多个国家批准作为食品添加剂使用，Roller和Covill［8］研究了壳聚糖在饮料中的应用，发现其对酵母真菌和霉菌有较好的抑菌效果，证明了其在食品中作为防腐剂的潜力。Staroniewicz［9］等通过实验确定了壳聚糖抑制微生物的MIC。Tsai等［10］认为，壳聚糖是通过破坏细胞膜杀死细菌，而细菌细胞膜损坏与壳聚糖的含量密切相关。张燕婉［11］报道了壳聚糖溶液浓度在0.5%～2.5%范围内对E.coli等菌有很好的抑菌效果，但许多因素影响着壳聚糖的抑菌能力，如温度、脱乙酰度等。

3.4Nisin是当前一种受到人们极为重视的天然防腐剂［12］。Nisin是带正电荷的疏水短肽，它可以作用在革兰氏阳性菌细胞壁上带负电荷的阴离子成分上，并与细胞壁形成管状结构，使得小分子量的细胞组成成分从孔道中泄露出来。因而Nisin对革兰氏阳性菌具有很好的抑制作用，而对其他细菌没有显著作用［13］。本试验同样证实Nisin对革兰氏阳性菌S.aureus的抑制效果较好，而对革兰氏阴性菌E.coli的抑制效果不好。

3.5虽然榆耳水提液和黑木耳多糖、壳聚糖、Nisin溶液这些天然防腐剂对S.aureus和E.coli均呈现较强的抑菌效果，但对不同菌有不同敏感性，抗菌谱也较窄。因此，本研究将4种天然抑菌物质进行复配，采用正交试验对其进行优化的结果表明，复合防腐剂对E.coli和S.aureus均有较强抑菌作用，其中榆耳水提液对复配液有显著影响，其次为Nisin，再次为黑木耳多糖，最后是壳聚糖。复合防腐剂的最佳配比为：榆耳干物质含量为2%，黑木耳多糖干物质含量为1.6%，Nisin 1%，壳聚糖0。

［1］张华，王振宇，杨鑫，等.黑木耳多糖的羧甲基化及其对肝癌细胞HepG2的抑制作用［J］.食品与机械，2011（3）:42-44+67.

［2］Joo N E，Ritchie K，Kamarajan P，et al.Nisin，an apoptogenic bacteriocin and food preservative，attenuates HNSCCtumorigenesis via CHAC1［J］.Cancer medicine，2012，1（3）:295-305.

［3］Yamazaki K，Murakami M，Kawai Y，et al.Use of nisin for inhibition of Alicyclobacillus acidoterrestris in acidic drinks［J］. Food microbiology，2000，17（3）:315-320.

［4］焦世耀.管碟法测定Nisin效价的改进［J］.食品科学，2005，26（5）:165-166.

［5］刘瑞君，李凤珍.榆耳的抗炎性研究［J］.中国食用菌，1990，9（3）:9-10.

［6］崔京春，郭海勇，邢效瑞，等.榆耳发酵液抑菌谱及抑菌作用稳定性研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2013，13:105-107.

［7］赵梦瑶，孔学琼，张拥军，等.不同处理工艺对黑木耳多糖抑菌活性影响研究［J］.中国食用菌，2011（2）:34-36.

［8］Roller S，Covill N.The antifungal properties of chitosan in laboratory media and apple juice［J］.International Journal of Food Microbiology，1999，47（1）:67-77.

［9］Staroniewicz Z，Ramisz A，Wojtasz-Pajak A，et al.Studies on antibacterial and antifungal activity of chitosan［J］.Chitin World. Wirtschaftverlag，Germany，1994:374-377.

［10］Tsai G J，Su W H.Antibacterial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli［J］.Journal of Food Protection，1999，62（3）:239-243.

［11］张燕婉.壳聚糖对五种食物中毒菌生长的影响［J］.微生物学报，1999，18（6）:344-347.

［12］Pattanayaiying R，Aran H，Cutter C N.Effect of lauric arginate，nisinZ，andacombinationagainstseveralfood-related bacteria［J］.International journal of food microbiology，2014，188:135-146.

［13］于见亮.冷却羊肉菌相分析及应用天然防腐剂复合保鲜技术的研究［D］.石河子大学，2008.

第1作者简介：冯磊（1981-），男，副研究员，主要从事非木材产品资源加工利用方面的研究。

（责任编辑：王岳）

Development of Natural Compound Preservative for Edible Fungi

FENGLei
（Heilongjiang Academy of Forestry，Harbin150081）

With S.aureus and E.coli as the test bacteria，using the cup plate method，investigation of Gloeostereum water extract，auricularia auricula polysaccharide，Nisin，Chitosan，antibacterial activity of natural preservatives.The results showed that the inhibitory effect of Gloeostereum incarnatum water extract，Auricularia auricula polysaccharide，Chitosan on E.coli strong in S.aureus，and Nisin on S.aureus better.The results of orthogonal test showed that the natural compound preservative had stronger antibacterial effect. The optimal ratio of compound natural preservative:Gloeostereum incarnatum dry matter content was 2%，Auricularia auricula polysaccharide 1.6%，Nisin 1%，Chitosan 0%.

Edible fungus；Gloeostereum incarnatum water extract；Auricularia polysaccharide；Antiseptic；Antibacterial

S718.81，TQ458

A

1001-9499（2016）04-0064-05

*黑龙江省森林工业总局重点科研攻项目sgzjY2012008；黑龙江省省属科研院所基本科研业务费专项

佟立君（1968-），男，研究员，从事非木质林产品加工、保藏方面研究。

2016-07-02