响应面法优化野生蛤蒌多糖提取工艺*

巫宝霞，杨桂珍，温智幸，姚小珍，林楚婷，钟　慧

(岭南师范学院化学化工学院，广东　湛江　524048)



响应面法优化野生蛤蒌多糖提取工艺*

巫宝霞，杨桂珍，温智幸，姚小珍，林楚婷，钟慧

(岭南师范学院化学化工学院，广东湛江524048)

采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定野生蛤蒌中多糖的含量及采用响应面设计法(RSM)优化野生蛤蒌多糖的提取条件。超声波辅助提取野生蛤蒌多糖，利用单因素试验和响应面法相结合的方法，确定最佳条件。通过试验，最佳测试波长为510 nm、显色剂用量为1.5 mL、显色时间5 min、HCl溶液的用量为0.15 mL，水解时间为20 min；在单因素试验基础上，结合响应面法优化确定提取野生蛤蒌多糖的最佳工艺条件如下：超声功率160 W，超声时间15 min，超声温度60 ℃，料液比1:16。此条件下蛤蒌的提取率为12.20%。

响应面法；蛤蒌；多糖；超声波提取；DNS法

蛤蒌，为胡椒科胡椒属植物，别名假蒌、大柄蒌、山蒌、毕拔子，为野生匍匐或攀援藤本，叶子有一种特异的香味[1]。另因其具有医疗保健功效，目前有将其制成美味菜肴[2],其实可以作现代副食品作料以及添加剂，如作为保健品开发，或作为特殊人群的保健食品(即作为营养强化剂直接加入食品中)[3]。另外，目前国内外对蛤蒌的提取物活性和其挥发油的提取进行了研究[4-7]，近年来，随着生活水平提高，人们逐渐注重健康保健，随之多糖作为保健食品[8-10]的成分已悄然兴起。本研究通过采用响应面设计法[11-14]对蛤蒌提取物中多糖的研究，从而为蛤蒌的食药两用及进一步开发提供科学的依据。

1　实　验

1.1试验材料

蛤蒌(供试)采摘于湛江市；由中国食品药品检定研究所提供芦丁标准样品；供试试剂：盐酸、无水乙醇、氢氧化钠均为分析纯。

DNS显色试剂的配制：参考文献[12]，加以修改。具体配制方法为：称取10.5 g NaOH固体配成浓溶液，再准确称取DNS 3.15 g溶于约200 mL水中，在温度为45 ℃水浴条件下边搅拌边依次加入91 g酒石酸钾钠，完全溶解后依次加入NaOH浓溶液，2.5 g苯酚及2.5 g无水亚硫酸钠，待完全溶解后，将溶液冷却至室温，然后转移至500 mL容量瓶中，定容，摇匀后转移至棕色瓶中，室温放置一周后使用。

供试仪器：UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；AUY120型电子分析天平，日本岛津天平有限公司；GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FW-200型高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；SB-3200DTDN超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D循环水式真空泵，河南巩义市英峪豫华仪器厂。

1.2试验方法

1.2.1材料预处理

将当地采摘的精心挑选出叶子完好、绿色的蛤蒌叶，用自来水洗3次，再用蒸馏水重复洗3次。置于烘箱中80 ℃恒温烘干至恒重，用粉碎机粉碎过筛，贮于玻璃瓶(干燥带塞)，置于干燥器中待用。

1.2.2提取剂的筛选

准确称取6份已处理好的蛤蒌粉1.000 g于洁净圆底烧瓶中，加入16 mL的无水乙醇以去除有色物质、单糖、低聚糖和小分子物质[10]，置于恒温80 ℃的恒温水浴锅中回流1 h后抽滤，取滤渣分别加入用蒸馏水、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60% 乙醇等6 种不同提取剂各16 mL，在60 ℃，功率为250 W，时间为15 min下超声。抽滤，各吸取滤液0.5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L盐酸于一支，20 min沸水浴，快速冷却加入4 mol/L NaOH调节pH至9，两支各加入1.5 mL DNS试剂，5 min沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为510 nm)，重复三次。

1.2.3液料比对多糖提取效果的影响

准确称取待用的蛤蒌粉1.000 g 5份于250 mL洁净圆底烧瓶中，分别加入12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL的无水乙醇，置于恒温80 ℃的恒温水浴锅中回流1 h后抽滤，取滤渣分别加入蒸馏水12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL，在60 ℃、功率为250 W、时间为15 min下超声。抽滤，各吸取滤液0.5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L盐酸于一支，20 min沸水浴，快速冷却加入4 mol/L NaOH调节pH至9，两支各加入1.5 mL DNS试剂，5 min沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为510 nm)，重复三次。

1.2.4超声温度对多糖提取效果的影响

准确称取待用的蛤蒌粉1.000 g 5份于250 mL洁净圆底烧瓶中，加入16 mL的无水乙醇，置于恒温80 ℃的恒温水浴锅中回流1 h后抽滤，取滤渣加入蒸馏水16 mL，分别在25 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，功率为250 W，时间为15 min下超声。抽滤，各吸取滤液0.5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L盐酸于一支，20 min沸水浴，快速冷却加入4 mol/L NaOH调节pH至9，两支各加入1.5 mL DNS试剂，5 min沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为510 nm)，重复三次。

1.2.5超声时间对多糖提取效果的影响

准确称取5份已处理好的蛤蒌粉1.000 g 于洁净圆底烧瓶中，加入16 mL的无水乙醇，置于恒温80 ℃的恒温水浴锅中回流1 h后抽滤，取滤渣加入蒸馏水16 mL、在25 ℃、功率为250 W，时间为10 min、15 min、20 min、25 min、30 min下超声。抽滤，各吸取滤液0.5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L盐酸于一支，20 min沸水浴，快速冷却加入4 mol/L NaOH调节pH至9，两支各加入1.5 mL DNS试剂，5 min沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为510 nm)，重复三次。

1.2.6超声功率对多糖提取效果的影响

准确称取5份已处理好的蛤蒌粉1.000 g 于洁净圆底烧瓶中，加入16 mL的无水乙醇，置于恒温80 ℃的恒温水浴锅中回流1 h后抽滤，取滤渣加入蒸馏水16 mL，在25 ℃，功率为100 W、130 W、160 W、190 W、220 W，时间为10 min下超声。抽滤，各吸取滤液0.5 mL于两支比色管(25 mL)中，加入0.15 mL 6 mol/L盐酸于一支，20 min沸水浴，快速冷却加入4 mol/L NaOH调节pH至9，两支各加入1.5 mL DNS试剂，5 min 沸水浴，快速冷却至室温，加蒸馏水定容，测定吸光度(波长为510 nm)，重复三次。采用DNS法分别测定样品提取液中还原糖和总糖的单糖含量，总糖与还原糖吸光度值的差就是样品中多糖水解为还原糖部分的吸光度值(A多糖=A总糖-A还原糖)。

式中：m——蛤蒌质量

1.2.7响应面优化设计试验

在单因素试验的基础上，以蛤蒌多糖提取率(Y)为响应值，用Box-Behnken 试验设计原理，选取液料比、超声温度、超声时间及超声功率为响应变量，用四因素三水平的响应面分析方法对蛤蒌叶多糖提取工艺进行优化。响应面分析因素与水平表见表1。

表1　Box-Behnken 设计方案(BBD)

2　结果与分析

2.1提取剂的筛选

由表2可知在6种提取剂中，吸光度最高是蒸馏水提取剂，吸光度达到0.035，而其他5种提取剂时的吸光度均在0.024～0.033 内，均比蒸馏水提取剂低。故以下试验中都采用蒸馏水为提取剂。

表2　蛤蒌多糖在不同溶剂中的溶解性

2.2不同液料比的选择

从图1可知，当提取剂体积小于16 mL时，随体积的增大，其吸光度不断增大，随之逐渐变小。当提取剂体积为16 mL，即液料比为1:16(g:mL) 时的吸光度值为最大，达到0.067，其多糖提取效果最佳。当提取剂体积大于16 mL 时，吸光度则随提取剂体积的增大而不断下降，这可能由于达到最高提取率后再提高液料比，浓度被稀释，吸光度又会下降。当提取剂体积为18 mL时，多糖提取液吸光值下降到最小值，为0.049。

图1　提取剂的影响

2.3不同超声时间的选择

从图2可知，在10～15 min时，随超声时间增长，吸光度增大，在15 min 达到最高，此时吸光度最大，为0.093而在20～35 min 间，随超声时间增长，吸光度反而下降，从0.078下降到0.042，这主要是多糖随提取时间延长而发生分解致使其吸光度下降。

图2　超声功率的影响

2.4不同超声温度的选择

从图3可知，随温度升高，吸光度不断增加，当温度达到60 ℃时吸光度达到最大值，为0.068。此后，吸光度值随温度的升高而不断下降。在70 ℃和80 ℃时的吸光值分别为0.054、0.053，基本达到一个平衡值。因此，当其他条件一定时，蛤蒌多糖提取的最适温度为60 ℃。

图3　超声提取时间的影响

2.5不同超声功率的选择

从图4可知，随功率的增大，吸光度不断增加，当功率达到160 W时吸光度达到最大值，为0.074。此后，吸光度值随功率的增大而不断下降。因此，当其他条件一定时，蛤蒌多糖提取的最适功率为160 W。

图4　微波功率的影响

2.6试验结果与模型建立

表3　BBD实验结果

依表1进行4个因素(液料比、超声温度、超声时间、超声功率)与多糖提取率之间的4因素3水平响应面法优化实验，试验方案和结果详见表3。对4个变量中心复合设计后所测得的蛤蒌多糖提取率结果见表2所示。

用Design Expert 8. 05 软件对表3数据进行二次多元回归拟合，得以提取液的吸光度Y(即多糖提取率)对编码自变量A、B、C、和D的二次多项回归方程多糖提取率=0.12+0.011A+5.467E-003B+3.385E-003C+5.741E-003D-1.225E-003AB+2.303E-003AC-2.550E-003AD+1.975E-003BC+3.950E-003BD-4.622E-003CD-0.024A2-0.026B2-0.028C2-0.025D2

式中A、B、C、D分别为料液比、超声时间、超声温度和超声功率的编码值。

据方差分析结果，上述回归方程描述与响应面值之间的关系时因其模型的极显著(P≤0.01)，差拟项检验的P=0.2759>0.05(不显著)，表明模型充分拟合试验数据，该方程是蛤蒌多糖提取率与提取工艺各参数的合适数学模型，所以，可以利用此回归方程确定蛤蒌多糖提取率的最佳提取工艺。一次项A、B，二次项A2、B2、C2、D2影响显著。即料液比，超声时间对多糖提取率的影响最为显著。

表4　方差分析

2.7响应面分析

从响应面(其是响应值对各试验因子A、B、C和D所构成的三维空间的曲面图)分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用，依据回归方程得出不同因子的响应面分析图及相应等值线图，结果见图5～图10。

从图5～图10中可较直观地看出各因素交互作用对蛤蒌中多糖得率的影响，当曲线越陡峭，表明该因素对多糖得率的影

响越大，则相应表现为响应值变化的大小。从等高线图可看出存在极值的条件应在圆心处。从图5～图10可以看出对多糖的得率影响最大是料液比，其次是超声时间，表3回归分析结果也正与此相吻合，料液比和超声时间二者对应的P值小于0.05，均达到了显著水平。

图5　料液比和时间对多糖产率影响的响应面3D图

图6　料液比和温度对多糖产率影响的响应面3D图

图7　料液比和功率对多糖产率影响的响应面3D图

图8　时间和温度对多糖产率影响的响应面3D图

图9　功率和时间对多糖产率影响的响应面3D图

图10　温度和功率对多糖产率影响的响应面3D图

2.8最佳工艺条件的验证

由Design Expert 8.05 软件得到蛤蒌多糖提取的最佳提取条件为液料比1:16.1(g:mL)、超声温度61.1 ℃、超声时间15 min，超声功率160W，在这条件下，蛤蒌多糖提取液的吸光度为0. 121。为了便于实际操作的情况，将最佳工艺条件修正为液料比1:16(g:mL)、提取温度61 ℃、提取时间15 min，在这条件下进行三次平行实验，得到蛤蒌多糖提取液的平均吸光度为0. 122，从而说明采用响应面法得到的优化工艺结果是可靠，具有一定的实用价值。

3　结　论

本研究采用响应面法优化蛤蒌多糖提取工艺参数，得出最

佳工艺条件如下：超声功率160 W，超声时间15 min，超声温度60 ℃，料液比1V16，此条件下蛤蒌多糖的提取率预测值为12.10%，蛤蒌多糖的提取率实验值为12.20%±0.25%，此条件下与预测值十分接近，可说明模型比较可靠，为大规模提取蛤蒌多糖提供了一定的参考。

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Optimization of Extraction of Polysaccharide from Piper Sarmentosum Roxb by Response Surface Methodology*

WUBao-xia,YANGGui-zhen,WENZhi-xing,YAOXiao-zhen,LINChu-ting,ZHONGHui

(Chemistry and Chemical Engineering, Lingnan Normal University, Guangdong Zhanjiang 524048, China)

The determination of polysaccharide in piper sarmentosum roxb with 3，5-Dinitrosalicylic acid colorimitry and the improvement of measuring conditions for polysaccharide in piper sarmentosum roxb with RSM were studied. In this experiment, with the assitant of the ultrasonic, we can draw a conlusion of the optimum conditions for the determination with the combination of single factor test and RSM. Acoording to the experiment, the perfact wavelength, the dosage of chromogeric，the coloring time, the dosage of saline solution and the hydrolysis time were determined as 510 nm, 1.5 mL, 5 min, 0.15 mL and 20 min. On the basic of single factor test, when the optimal technical conditions including ultrasonic power, ultrasound time, tempereture of ultrasonic and the ratio of material liquid can individually reach 160 W, 15 min, 60 ℃ and 1:16, it can get the highest extraction rate of polysaccharide in wild clams with RSM. The highest extraction ratio can reach 12.20%.

the response surface method；piper sarmentosum roxb；polysaccharide ultrasonic extraction；DNS colorimetry

大学生创新训练项目(201310579004)资助。

巫宝霞(1992-)，女，本科，在读学生。

杨桂珍。

TS201.1

B

1001-9677(2016)05-0089-05