内标法与外标法测定氨薄荷酊中薄荷脑含量的比较

吴松涛，段雪云

(1 湖北中医药大学药学院，湖北　武汉　430065；2 湖北省中医院，湖北　武汉　430061)



内标法与外标法测定氨薄荷酊中薄荷脑含量的比较

吴松涛1，段雪云2

(1 湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065；2 湖北省中医院，湖北武汉430061)

为了对氨薄荷酊测量薄荷脑含量，用内标法和外标法对所得结果进行比较，并改进原有质量标准。用自动进样气相色谱对氨薄荷酊进行测定，通过内标法和外标法可得氨薄荷酊中待测物含量。内标法和外标法薄荷脑含量测定结果有显著性差异,在准确度和精密度上内标法优于外标法。实验人员根据实验条件，应尽量选择内标法。

氨薄荷酊；薄荷脑；气相色谱法；内标法；外标法

氨薄荷酊为湖北省中医院自制制剂，具有清热解毒，凉血止痛、止痒的功能，临床上用于蚊叮虫咬等[1]。现行氨薄荷酊质量标准中的NH3的含量测定为化学测定法，实验对氨薄荷酊的含量测定进行研究以更好的控制该制剂质量。薄荷脑的测定常用方法有外标法[2]、内标法[3]、一测多评法[4]和归一化法[5],但却并未找到相关方法比较的文献。为找到方便、准确的测定方法，实验对内标法和外标法进行比较。

1　实　验

1.1实验材料

自动进样气相色谱仪(PerkinElmerClarusGC580，氢火焰离子化检测器FID)；电子分析天平(PrecisaES225SM-DR)；薄荷脑对照品(110728-2005506)；水杨酸甲酯对照品(110707-201413)；氨薄荷酊(自制)；氨水、无水乙醇为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1色谱条件

固定相毛细管柱(交联键合聚乙二醇)，30m×0.323mm×1.20μm；柱温：120 ℃；柱流量：高纯氮3.2mL/min(恒流) ；气体流量：氢气 45mL/min，空气 450mL/min，FID尾吹气30mL/min。进样口：250 ℃；检测器：250 ℃。进样方式：分流进样，分流比10:1[6-8]。

1.2.2溶液的制备

(1)内标溶液：向10mL量瓶中精密加入水杨酸甲酯[9]对照品0.1068g，加无水乙醇至刻度，作为内标储备液，向10mL容量瓶加入储备液1mL，加无水乙醇至刻度，得浓度为1.068mg/mL的内标液。

(2)供试品溶液：向25mL容量瓶精密加入氨薄荷酊1mL(批号20140710)，稀释得1mg/mL供试品储备液。向10mL量瓶精密加入内标液和供试品储备液2mL，加无水乙 醇至刻度，既得供试品溶液。

(3)对照品溶液：于50mL容量瓶精密加入薄荷脑24.1mg,加无水乙醇至刻度得0.482mg/mL的对照品溶液。

1.2.3专属性试验

按照供试品溶液的制备方法取薄荷以外的其余药味，制得阴性对照溶液。如1.2.1所述设定色谱条件，发现在薄荷脑对照品相同保留时间处无干扰峰，可知薄荷含量脑测定不受其余药味的干扰，见图1。

图1　HPLC色谱图

1.2.4线性关系考察

向10mL量瓶精密加入薄荷脑对照品溶液(482.0μg·mL-1)1、3、5、7、9mL，再分别加入2mL内标液，加无水乙醇至刻度，得浓度为48.2、144.6、241、337.4、433.8μg·mL-1的对照品溶液。按上述色谱条件,精密吸取配制好的不同浓度的对照品溶液1μL，进行测定。内标法：以薄荷脑与内标物的峰面积之比为因变量,以药物质量(μg)为自变量进行线性回归，求得线性回归方程。外标法：以薄荷脑峰面积为因变量，以药物质量 (μg)为自变量进行线性回归，求得线性回归方程。薄荷脑线性回归方程为：(外标法)y=0.7011x+4.7682，R2=0.9991(n=5)，(内标法)y=0.8899x+0.7546，R2=0.9995(n=5)，薄荷脑在0.0482～0.4338μg范围内线性关系良好。

图2　线性关系图

1.2.5精密度试验

精取薄荷脑对照品溶液(433.80μg·mL-1)，如1.2.1所述设定色谱条件，重复测定6次，进样量1μL。以测出的峰面积计算RSD值，可得内标法为0.63%，外标法为0.86%，可知仪器精密度良好。

1.2.6稳定性试验

配制后的0、2、4、6、8、12、24h测定氨薄荷酊供试品溶液薄荷脑与内标物峰面积，进样量1μL。以测出的峰面积计算RSD, 可得内标法为0.18%，外标法为1.14%，可知24h内供试品溶液稳定。

1.2.7重现性试验

按1.2.1所述设定色谱条件，精取本品(批号20140710)样品约1mL，共5份，按供试品溶液制备方法制备，进样量1μL，进行测定。薄荷脑含量RSD，内标法为0.20%，外标法为0.54%，表明方法重复性良好。

1.2.8加样回收试验

精取氨薄荷酊供试品溶液(含量为234.15μg·mL-1，批号20140610)4mL，共六份，加入薄荷脑对照品溶液(241.0μg·mL-1)2、4、6mL，进样量1μL,以测出的含量来计算回收率，结果见表1，得RSD值，外标法为2.3，内标法为1.1。

表1　薄荷脑加样回收率(n=6)Table 1　Recovery rate of menthol(n=6)

2　结果与讨论

2.1样品含量测定

依法精取6个不同批次的样品制成供试品溶液，自动进样程序设定进对照品溶液(433.8μg·mL-1和48.2μg·mL-1)1μL，供试品溶液1μL，如1.2.1所述设定色谱条件，每批样品测2份，分别用外标法和内标法计算薄荷脑含量，结果如表2所示。

表2　六批氨薄荷酊中薄荷的含量测定(n=6)Table 2　Content of mint elixirs in 6 batches of menthol(n=6)

续表2

20140710外标法0.272820.295490.28438内标法0.246920.222260.2345920140720外标法0.266850.289350.27810内标法0.245480.222820.2341520140810外标法0.267120.291140.27913内标法0.246150.224110.2351320140820外标法0.269330.291630.28048内标法0.246520.222520.23453

2.2两种方法的比较及显著性差异分析

对内标法和外标法测得的薄荷脑含量数据进行统计分析(见表3)，表明内标法在准确度和精密度两方面强于外标法。再对两法对氨薄荷酊中薄荷脑含量测定数据进行F,t检验，结果见表3。显然，内标法和外标法测得的各组数据在水平α=0.05下,F值大于F0.05(5,5)=5.05,t值大于t0.05，10=51.07，这说明薄荷脑含量测定中两种定量方法之间有显著性差异，分析人员在条件允许下应尽量选择内标法。

表3　内标法与外标法测定薄荷脑结果的分析Table 3　The analysis on determination of menthol with ISTD and ESTD

3　结　论

外标法可靠标准工作曲线直接算出含量，适于分析大量样品。但由于色谱条件很难保持一致，容易发生较大误差。且用标准样品来绘制标准曲线对前处理中待测组分的变化没有补偿。

以内标物及待测组分的峰面积的比值为因变量的内标法， 系统误差相对减少。待测组分在样品前处理时的损失由于前处理前加入内标物，得到部分补偿。操作程序较麻烦，有时寻找合适的内标物也有困难是内标法的缺点[10]。

本实验经对两法的比较及显著性差异分析，两法分析薄荷醑中薄荷时应首选内标法。

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Comparison Analysis on Determination of Menthol in Mint ElixirswithISTDandESTD

WU Song-tao1, DUAN Xue-yun2

(1 School of Pharmacy, Hubei University of Traditional Chinese medicine, Hubei Wuhan 430065;2 Hubei provincial Hospital of traditional Chinese medicine, Hubei Wuhan 430061, China)

TocomparewhethertheresultsofInternalStandardMethod(ISTD)andExternalStandardMethod(ESTD)determiningthementholconcentrationaresignificantdifferentandimprovethequalitystandard,makinguseofthegaschromatographtodetectmentholwithISTDandESTD.TheaccuracyandprecisionofISTDwerebetterthanonesofESTD,simultaneouslytherewasasignificantdifferenceinthequantitativeresultsofmentholwithISTDandESTD.TheanalyzersshouldchooseISTDbasedontheirexperimentalconditions.

mintelixirs;menthol;gaschromatography;ISTD;ESTD

吴松涛(1991-)，湖北中医药大学2014级研究生，研究方向：中药新制剂、新剂型的研究。

段雪云(1966-)，主任药师，研究方向：中药新制剂、新剂型的研究。

R451

A

1001-9677(2016)013-0125-03