中性蛋白酶在麦迪霉素溶媒萃取中的破乳作用

蓝灿华　吴菲菲　郑丹梅　黄琳（.福建师范大学生命科学学院，福州3507；2.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福州3507）



中性蛋白酶在麦迪霉素溶媒萃取中的破乳作用

蓝灿华1,2吴菲菲1郑丹梅1黄琳1
（1.福建师范大学生命科学学院，福州350117；2.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福州350117）

研究一种利用AS1.398中性蛋白酶大幅度减轻麦迪霉素溶媒（醋酸丁酯，BA）萃取时乳化现象的方法，通过正交试验确定综合效果最佳的酶反应条件：酶加量（En）0.10%，温度37℃，pH 7.0，搅拌时间60m in。在该条件下，可以减轻84%的乳化。利用该法破乳，麦迪霉素的成品质量和提取收率不受影响，而溶媒损耗却降低28%，并且可以改善劳动条件，达到节能、环保的目的。

AS1.398中性蛋白酶麦迪霉素溶媒萃取破乳

溶媒萃取法因其具有快速、高效、简便、经济等优点而一直在抗生素提取领域占据着重要地位，广泛应用于青霉素、红霉素和其他许多抗生素的提取。然而，形成稳定的乳化液又是溶媒萃取过程中经常遇到的问题，乳化会造成萃取之后有机相与水相分离困难，使产品和溶媒随着水相的排除而受损失［1-2］，影响其收率，明显增加成本，同时还会造成环境污染。

人们普遍认为，发酵液中含有大量的菌丝体、蛋白质和肽类等大分子物质，是引起溶媒萃取时严重乳化的主要原因［1，3］，这些蛋白质分散成微粒，呈胶体状态，用溶媒萃取时，能在溶媒相和水相界面上形成保护膜，使乳化液变稳定。

工业上已有几种方法用于解决乳化问题。最常用的方法是萃取前就加入破乳剂来减轻或避免乳化现象，另一种就是用高速离心机进行两相分离。传统使用的破乳剂主要有二种：一种是阳离子表面活性剂溴代十五烷基吡啶（PPB）和十二烷基三甲基溴化铵［3］；另一种是阴离子表面活性剂溴化十六烷基吡啶（CPB）或十二烷基硫酸钠（SDS）。这些破乳剂根据发酵液的性质不同，破乳效果也不尽相同，破乳剂的价格较昂贵，且本身有一定毒性，排放含有破乳剂的废液会污染环境［4］。

近年来，一些抗生素生产企业正在寻找毒性低、价格较低廉的新型破乳剂，取得了一定的成效［5］。

还有一些抗生素生产企业与专业的萃取剂制造商合作，设计生产出专门用于某种抗生素提取的新型萃取剂，既避免使用破乳剂，又方便回收利用［6］。

高速离心萃取机的使用可谓“历史悠久”，但有时并不能将油水两相完全分开，耗能也十分巨大，而且操作人员的工作条件也相对较差。

针对发酵液中含有的蛋白质等大分子物质引起乳化的问题，越来越多的企业采用截留分子量为10 000的超滤膜滤除发酵液中的大分子蛋白质，结果既克服了乳化现象，又提高了产品收率和质量［2，4］。但是，超滤膜的一次性投资较大，运行一段时间后还会出现浓差极化和膜污染等问题。

去除发酵液中的蛋白质等大分子物质的另一条思路就是利用蛋白酶将蛋白质大分子水解成氨基酸或肽类。国外有人用无花果朊酯酶、菠萝朊酶及木瓜酶来破除青霉素、链霉素、红霉素和四环素等提取过程中的乳化现象，而国内在这方面的研究鲜有报道，本文即选用AS1.398中性蛋白酶对麦迪霉素提取时的严重乳化现象进行破乳试验。

1　材料与方法

1.1材料AS1.398中性蛋白酶（5万单位/g，山东龙元生物工程有限公司生产）；醋酸丁酯（工业级）；草酸（工业级）；烧碱（工业级和化学纯）；磷酸二氢钠（化学纯）；活性碳（药用级）；麦迪霉素发酵液，由本实验室培养所得。

1.2方法

1.2.1加酶试验麦迪霉素放罐发酵液中加入草酸搅拌、酸化至适当pH后，用尼龙布袋悬吊过滤，滤液装入1 000 mL烧杯中，用烧碱调至一定pH，置于水浴锅中，维持恒定温度，加入一定量的AS1.398中性蛋白酶，电动搅拌一段时间后，立即转入分液漏斗中，加一定量醋酸丁酯，用烧碱调pH至8.8～9.0，充分振摇，静置约15 h（过夜），分层，分去下层水相，溶媒层倒入量筒计量澄清醋酸丁酯的体积和总体积，然后将此溶媒层进行真空抽滤，得到的醋酸丁酯提取液用磷酸二氢钠-草酸缓冲液抽提，抽提液（水相）经活性碳脱色、过滤后，滤液用氢氧化钠（C.P）调pH至7.0，结晶得到麦迪霉素湿粉，烘干后得成品。

1.2.2对照试验放罐发酵液加草酸酸化、过滤后，所得滤液不加入AS1.398中性蛋白酶，直接用醋酸丁酯抽提，其余步骤同1.2.1。

1.2.3麦迪霉素发酵滤液和成品效价的测定采用生物检定法。

表1　因素水平表

表2　酶反应条件的正交试验

2　结果与分析

2.1酶反应条件的正交试验采用正交试验，考察发酵滤液中加入AS1.398中性蛋白酶水解蛋白质时，影响酶反应的酶加量（En）、温度、pH和搅拌时间四个主要因素。表1为因素水平表。

正交试验结果表明（见表2）：S3＞S2＞S1＞S4，可以看出，在试验所考察的范围内，pH和温度对AS1.398中性蛋白酶的作用影响较大，其次是酶加量和搅拌时间。同时表明：破乳效果最好的酶反应条件为：A2B1C3D3，即酶加量0.15%，温度37℃，pH7.0，搅拌时间90 min。

2.2最佳酶反应条件的调整

2.2.1酶加量的调整从表2可以看出，M11与M3l相差0.16，而M2l与M11只相差0.08，说明当酶加量（En）从0.05%提高到0.10%时，萃取时的乳化程度减轻较明显，而酶加量再由0.10%继续增加到0.15%时，乳化程度减轻不那么明显。为了尽量降低成本，提高经济效益，使酶反应的条件更适合于工业化生产，将上述酶反应条件中的酶加量（En）调整为0.10%。

2.2.2酶反应时间的调整酶反应时，搅拌时间较长会使麦迪霉素发酵滤液中的单位损失增加。搅拌时间在30～60min，麦迪霉素单位损失不多（小于3.5%）；搅拌时间达到90min时，单位损失在50～80 U/mL（约4.5%～6.4%），见表3。为了缩短工业生产中的操作时间，尽量减少麦迪霉素单位损失，保证提取收率，将相对次要的搅拌时间调整为60min。

表3　搅拌时间对麦迪霉素单位的影响

注：温度为37℃，pH 7.0。

2.2.3最佳酶反应条件的验证为了确认最佳酶反应条件的有效性和可靠性，利用调整后的最佳酶反应条件进行验证试验。结果证明，经过调整后的最佳酶反应条件，能保证稳定地减轻麦迪霉素发酵滤液溶媒萃取时的绝大部分乳化现象，见表4。

表4　酶反应条件的验证试验

2.2.4酶反应对成品质量、收率及成本的影响利用最佳酶反应条件，比较加酶和不加酶两种情况下麦迪霉素的提取收率、成品质量和醋酸丁酯单耗。由表5可以看出，采用AS1.398中性蛋白酶后，提取收率和成品质量基本不受影响，而醋酸丁醋单耗却比不加酶时降低28%。

AS1.398中性蛋白酶的价格为15.5元/kg，按表5中的试验数据计算，每批试验的酶加量为2 g（2 L滤液），增加成本0.031元。每批活性产量平均为l.238 g，则单位活性成本增加0.0250元/g。

而使用中性蛋白酶后，需要通过真空抽滤或离心机离心破乳的乳化层的量很少，操作时间大大缩短，醋酸丁酯单耗下降8.8mL/g，即每克成品醋酸丁酯用量下降7.766 g。其价格按5.10元/kg计，则单位成本降低0.0396元/g。所以，使用中性蛋白酶后，原材料成本实际降低0.0146元/g，折合每千克成品降低14.6元。

表5　加酶与不加酶的对照试验

综上所述，既能保证破乳效果，又能保证成品质量、收率不受影响，而原材料成本却降低的最佳酶反应条件为：酶加量（En）0.10%，温度37℃，pH7.0，搅拌时间60 min。

3　讨论

1）在麦迪霉素发酵滤液中加入AS1.398中性蛋白酶保温水解一段时间，可大大减轻醋酸丁酯在萃取时的乳化现象，成品质量和收率不受影响。

2）由于乳化程度大幅度减轻，萃取所得溶媒相的绝大部分为澄清溶媒，可不经过离心机离心（小试验则不需要抽滤）而直接分离出来，剩下的乳化液量少，需用离心机离心破乳的时间短，可降低溶媒损耗，同时还大幅度节省了离心机破乳时的电力消耗，并且降低了操作人员的劳动强度，改善了环境。

3）互不相容的有机溶媒与水在一定强度的搅拌、振荡或混合操作下均能产生乳化现象，但是，只要没有乳化液稳定剂的存在，乳化液就不会稳定，静置一段时间就会重新分离成界面清晰的油、水两相。在抗生素发酵培养过程中，由于培养基中所含大量蛋白质未被微生物彻底代谢利用，微生物在培养过程中还会合成各种蛋白质类代谢产物，在溶媒萃取之前若未被去除，就将成为乳化液的稳定剂。

乳化液的稳定性与稳定剂的分子大小有关。Sandra Lennie等曾报道，出芽短柄霉（Aureobasidium pullulans）发酵液经过离心去除菌丝后的澄清滤液用醋酸丁酯等三种溶媒萃取时形成稳定的乳化液。当发酵液用截留分子量为10 000的超滤膜过滤后，超滤液的乳化稳定性仅比蒸馏水稍微强一些。由此推断，使乳化液稳定化的是发酵液中的大分子，而这些大分子可能就是蛋白质［1］。

4）AS1.398中性蛋白酶是一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生的蛋白酶，能在中性pH条件下作用于蛋白质的肽键，将蛋白质水解成多肽和氨基酸［7-9］。这种酶对于被作用的肽健的两端没有严格的要求，只要求组成肽键的氨基端有一个疏水基团。因此，能水解具有这种结构的所有蛋白质。而对于不含这种肽键结构的蛋白质就不能起水解作用。根据抗生素发酵所使用的氮源的不同，以及微生物对这些氮源的分解代谢和合成情况的差异，放罐发酵液中残留的蛋白质种类和数量也不相同，AS1.398中性蛋白酶的水解效果就不同。另外，这种酶对于非蛋白质因素所引起的乳化现象不能起破乳作用，所以，在应用时，尚有少量乳化层。

［1］Sandra Lennie,Peter JHalling,George Bell.Causes of Emulsion Formation during Solvent Extraction of Fermentation Broths and its Reduction by Surfactants［J］.Biotechnology and Bioengineering,1990,35：948-950.

［2］冯建立,许振良,王学军,等.超滤去除红霉素发酵液乳化现象的研究［J］.中国抗生素杂志,2007,32（3）：150-153.

［3］杨智发,于淑秋,陈家镛,等.从发酵液中萃取青霉素时用阴、阳离子表面活性剂作破乳剂的研究I：阳离子表面活性剂［J］.化工冶金,1992,13（4）：302-307.

［4］李锡源,栾宝林,韩贵安.超滤法在抗生素提炼中的应用［J］.水处理技术,1996,22（4）：213-216.

［5］李伯良,孙建敏,戴焰明.新型高效破乳剂在红霉素萃取中的应用研究［J］.医药工程设计杂志,2005,26（1）：10-12.

［6］胡麦霞,文美乐,郑飞,等.新型萃取剂在红霉素提炼中应用研究［J］.医药工程设计杂志,2005,26（4）：7-8.

［7］许波,黄遵锡,陈金全,等.枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达［J］.云南师范大学学报：自然科学版,2005,25（3）：51-56.

［8］M cConn JD,Tsuru D,Yasunobu D T.Bacillus subtilis neutral proteinaseⅠ：A zinc enzyme of highspecific activity［J］.J Biol Chem,1964,239：3706-3715.

［9］冯培刚,张莉莉,王恬.枯草杆菌1398中性蛋白酶一些性质的研究［C］//刘建新.中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集（杭州）.北京：中国农业科学技术出版社,2008.

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Em ulsion breaking during solvent extraction process ofm edicam ycin using a neutral protease

Lan Canhua1，2Wu Feifei1Zheng Danmei1Huang Lin1
（1.College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350117；2.Engineering Research Center of IndustrialMicrobiology，Ministry of Education，Fujian Normal University，Fuzhou 350117）

A method for greatly reducing butyl acetate（BA）emulsification in the solvent extraction process of medicamycin using AS1.398 neutral proteasewas developed.The optimum enzymatic reaction conditionswere obtained by employing an orthogonal experiment：enzyme dosage（En）0.1%，temperature 37℃，pH7.0，reaction time 60 min.With the optimum conditions，BA emulsification was reduced by 84%.The product quality and yield ofmedicamycin were not affected by this demulsification method，and the solvent loss was reduced by 28%.Furthermore，theworking conditions of solventextraction was improved，and a purpose of energy saving and environmental protection was achieved.

AS1.398 neutral protease medicamycin solventextraction demulsification

A

1003-4331（2016）03-0020-04

福建师范大学卓越人才培养计划（zy201403007）项目资助。