猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用

朱海侠　曾亮明　傅星源　张蕴冰　陈雷　张渊魁（福州大北农生物技术有限公司福州350014）



猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用

朱海侠曾亮明傅星源张蕴冰陈雷张渊魁*
（福州大北农生物技术有限公司福州350014）

根据GenBank中猪流行性腹泻（PED）疫苗株与野毒株ORF3的特点设计特异性引物，建立能够快速区分PEDV疫苗株与野毒株的RT-PCR检测方法。建立的RT-PCR检测方法能够对PEDV疫苗株与野毒株扩增出特异性片段，其大小分别为278 bp和327 bp。该方法具有快速、特异、通用等特点，可用于实验室快速诊断、野毒株的区分，为该病的诊断及免疫防控提供参考依据。

猪流行性腹泻疫苗株野毒株

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病［1］。该病主要以腹泻、呕吐、脱水以及哺乳仔猪的高致死率为特征，各年龄段、不同品种猪均可发病。该病于1971年首次在英国报道［2］，此后在世界范围内均有报道［3-4］。我国于1976年首次报道该病，并于1980年首次分离到PEDV［5］，随后在世界各地呈现大面积流行［6-7］，给养猪业带来巨大的经济损失。

本研究利用PEDV ORF3基因强弱毒株有49～51 bp缺失的特性设计特异性引物，通过一次试验即可解决是否有PEDV感染以及是疫苗毒感染还是野毒感染或共感染的情况，极大地降低检测时间和检测成本，此外也为该病的流行病学调查及免疫防控提供参考依据。

1　材料与方法

1.1病毒株PEDV野毒株由本实验室分离；PED活疫苗（毒株ZJ-08株）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均由福州大北农生物技术有限公司提供。

1.2主要试剂RNA viral Kit购自Omega公司；AMV反转录酶、HPRI、Random primer、DL2000 DNA Marker和dNTPs（2.5mmol/L）均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR Master Mix（2×）购自天根生化科技有限公司。

1.3引物设计与合成参照GenBank中登录的PEDV ORF3基因序列，利用Primer Permier 5.0和Oligo 7.0软件设计特异性引物。引物序列为：F：GGCGCAATTATATTATGTTGG；R：CACGTATAGCTA GATACAAGTCA；引物均由Invitrogen公司合成。

1.4病毒RNA的提取和CDNA的合成按照RNA viral kit提取总RNA。按照AMV反转录酶使用说明书进行反转录合成CDNA，-20℃保存备用。

1.5PCR扩增以提取的样品CDNA为模板，用所设计的特异性引物进行PCR扩增，反应体系50 uL，其中：2×Mix 25 uL、上下游引物（20 umol/mL）各1 uL、cDNA 1 uL，补充去离子水至终体积为50 uL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性50 s，55℃退火35 s，72℃延伸25 s，30个循环；72℃延伸10 min。反应结束后，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6引物特异性试验分别以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（HCV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）为模板进行RT-PCR扩增，以验证该方法的特异性。

1.7检测方法的应用用建立的RT-PCR检测方法对送检的临床样品进行检测，并设立阴性对照。

2　结果与分析

2.1PEDV疫苗株与野毒株的扩增该方法能够对疫苗株扩增出一条大小为278 bp的目的片段，对野毒株扩增出一条大小为327 bp的目的片段，其大小与预期目的片段一致，差异明显（见图1）。将目的条带进行纯化、克隆、测序，经Blast比对分析，与GenBank中的PEDV ORF3序列相似度高达99%以上。

2.2特异性试验分别对猪源性病毒：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（HCV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）进行RNA提取与CDNA合成，以这3种CDNA为模板进行RT-PCR扩增。扩增结果显示（见图2），该方法具有良好的特异性，不会在实际应用中引起非特异性扩增。

2.3RT-PCR鉴定方法的应用采用建立的RTPCR检测方法对2016年1月份以来送检的37份疑似PEDV感染猪粪样、呕吐物及肠道内容物CDNA进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，37份样品中有30份能检测到PEDV，其中野毒感染13份，疫苗毒与野毒共感染的为17份，提示疫苗接种已难以控制该病的流行。

3　结论

目前已有多种PEDV检测方法建立的报道。李长龙等［8］建立了能够区分猪流行性腹泻疫苗毒与野毒的RT-PCR检测方法，可用于PEDV诊断及流行病学调查；刘琦等［9］建立巢式PCR法；修金生等［10］根据野毒株和弱毒疫苗株在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异，建立了能够区分疫苗毒与野毒的SYBR Green I检测方法。

本文成功建立了鉴别诊断PEDV疫苗株与野毒的RT-PCR检测方法，该方法具有操作简单、用时少、花费低等特点。利用该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（HCV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等猪源性病毒的检测结果均为阴性，说明该方法具有很好的特异性。目前PED的流行趋势较为严峻［11］。Gao等［12］报道了变异PEDV在我国发病猪场中占主导地位。临床检测结果发现，大部分发病猪只中存在疫苗株与野毒共感染的特点，提示目前流行的仔猪流行性腹泻很有可能是由猪流行性腹泻病毒变异株引起的，仅采用经典株疫苗进行免疫，已经难以达到有效的防控目的，应根据检测数据及临床使用结果给予合理的免疫接种。

［1］施标,董世娟,朱于敏,等.中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究进展［J］.中国农业科学,2013,46（20）：4362-4369.

［2］Penanert M B,de Bouck P.A new coronavirus-like particle associated w ith diarrhea in sw ine［J］.Archives of Virology, 1978,58（3）：243-247.

［3］Debouck P,Pensaert M.Experimental infection of pigs w ith a new porcine enteric coronavirus,CV777［J］.American journalof veterinary research,1980,41（2）：219-223.

［4］Takahashi K,Okada K,Ohshima K.An outbreak of sw ine diarrhea of a new-type associated w ith coronavirus-like particles in Japan［J］.Nippon juigaku zasshi the Japanese Journal of Veterinary Science,1983,45（6）：829-832.

［5］Xuan H,Xing D,Wang D,et al.Study on the culture of porcine epidem ic diarrhea virus adapted to fetal porcine primary cell monolayer［J］.Veterinary Science in China, 1984,4（3）：202-208.

［6］Chen Q,Li G,Stasko J,et al.Isolation and characterization of porcine epidem ic diarrhea viruses associated w ith the 2013 disease outbreak among sw ine in the United States［J］.JournalofClinicalM icrobiology,2014,52（1）：234-243.

［7］倪艳秀,林继煌,何孔旺,等.猪流行性腹泻研究概况［J］.畜牧与兽医,2001,33（1）：38-40.

［8］李长龙,陈建飞,张鑫,等.猪流行性腹泻病毒野毒株/疫苗株RT-PCR鉴别诊断方法的建立［J］.中国兽医杂志, 2014,50（6）：6-8.

［9］刘琦,冯晓声,周如月,等.鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用［J］.广东畜牧兽医科技,2015,40（2）：36-38.

［10］修金生,陈小权,王斌,等.基于SYBR I实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立［J］.中国动物传染病学报,2012,20（5）：16-21.

［11］王福军,林晴,许先明,等.近期暴发仔猪流行性腹泻的探讨［J］.福建畜牧兽医,2013,35（1）：38-40.

［12］Gao Y,Kou Q,Ge X,et al.Phylogenetic analysisof porcine epidem ic diarrhea virus field strains prevailing recently in China［J］.Archivesof Virology,2013,158（3）：711-715.

Establishm ent and app lication of RT-PCR assay for detection of PEDV vaccine and w ild strains

Zhu Haixia Zeng Liangming Fu Xingyuan Zhang Yunbing Chen Lei Zhang Yuankui*
（Fuzhou DaBeiNong Bio.Tech.Co.，Fuzhou 350014）

Based on the characteristics of porcine epidemic diarrhea（PED）gene in ORF3 between vaccine and wild strains，one pair of primers was designed and a rapid diagnostic method of RT-PCR was established.The established method had a rapid and general features and itonly amplified target band from PEDV.A total of 278 bp bandswere amplified from vaccine strains and 327 bp bands were amplified from wild strains.A highly special RT-PCR method was established and it can directly differentiate PEDV vaccine strains and wild strains，which can be provide reference for diagnosis and the immune prevention.

Porcine epidem ic diarrhea（PED）Vaccine strain W ild strain

A

1003-4331（2016）03-0014-03

福州大北农生物技术有限公司畜禽常见病免疫防控技术研究专项基金资助。

朱海侠（1986-），女，助理兽医师，硕士研究生。

张渊魁，男，高级兽医师。

E-mail：zhang.yuankui@qq.com。