反向电压下场放大进样毛细管电泳分析磺胺类药物

孙　彤，张　营，翁前锋

(辽宁师范大学化学化工学院，辽宁　大连　116029)



反向电压下场放大进样毛细管电泳分析磺胺类药物

孙彤，张营，翁前锋

(辽宁师范大学化学化工学院，辽宁大连116029)

采用反向电压下场放大进样富集技术，建立了四种磺胺类药物的毛细管区带电泳分析方法。确立了优化的实验条件，电泳缓冲液为22.5 mmol/L Na2HPO4-0.8 mmol/L CTAB-18%ACN，pH 8.70，样品溶于0.1 mmol/L NaOH溶液，电泳电压：-20 kV，检测电位：1.10 V，进样方式为-13 kV×20 s。四种磺胺类药物在该方法条件下检出限可达10-9～10-10mol/L水平。

毛细管区带电泳；反向电压；场放大进样；磺胺类药物

磺胺类药物是一种广谱抗菌药，临床上主要用于预防和治疗细菌感染性疾病[1-2]。其性质稳定，产量大、品种多、价格低，因此畜牧养殖业中常将其作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物。但是磺胺药摄入过多会损害肾脏，中枢神经系统和引起胃肠道反应，且可能致癌[3]，许多国家和地区严格限制磺胺类药物在食品中的最大残留量(例如，在欧洲地区和中国台湾限量100 μg/kg[4])。由于它对环境和健康潜在的威胁，对食品、动物组织和环境水样等复杂基体中磺胺类药物残留量的分析已经引起了广泛的关注。

目前测定各种基质中磺胺类药物的主要分析方法有高效液相色谱法、毛细管电泳(CE)和气相色谱等[5-8]。CE因为其分离效能高、分离时间短、样品用量少和有机溶剂用量很少等特点，较其它方法有无可比拟的优势。在线富集方法结合CE技术联用可以显著提高分析灵敏度，适用于低含量药物残留的分析。

本文建立了一种磺胺类药物的毛细管电泳分析新方法。采用电化学安培检测，反向电压下，毛细管区带电泳结合场放大进样实现了对四种常见磺胺类药物的检测。在优化条件下，四种磺胺类药物在15 min内可以完全分离。磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲基嘧啶四种检测物质在5×10-8～5×10-6mol/L范围内呈良好的线性关系。相关系数分别为0.9900、0.9766、0.9837、0.9915。

1　实　验

1.1主要实验设备

自组装毛细管电泳装置(配有JF-01电化学伏安检测器),山东省化工研究院；2003高压电源,北京宾达英创科技有限公司；熔融石英毛细管柱(i.d. 25 μm×60 cm), 河北永年光导纤维厂；KQ2200DB数控型超声波清洗机,昆山市超声仪器有限公司；三电极体系；碳纤维微盘电极为工作电极；饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝为辅助电极。

1.2试剂和溶液

磺胺嘧啶(SD)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺二甲基嘧啶(SM2),Aladdin Chemstry Co., Ltd.。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、磷酸氢二钠、乙腈(ACN),购自天津科密欧化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。电泳缓冲溶液为22.5 mmol/L Na2HPO4-0.8 mmol/L CTAB-18%ACN，并通过0.45 μm滤膜过滤。

1.3电泳过程

每次毛细管使用前分别用1 mol/L NaOH(5 min)，水(5 min)，乙腈(5 min)，水(5 min)，电泳缓冲液(5 min)冲洗毛细管。其他条件在正文和图表中详细介绍。

2　结果与讨论

2.1方法原理

电泳缓冲液中含有不高于临界胶束浓度的阳离子表面活性剂CTAB, 因此分离模式为毛细管区带电泳。当毛细管两端施加负高压，电渗流方向由高压负极指向正极，即电渗流反向。磺胺类药物在碱性溶液中带负电荷，电泳方向指向高压正极，与电渗流反向一致。此时，待测样品的迁移速度等于电渗流的速度与电泳速度之和，如图1所示。场放大进样是将样品溶解于低电导的溶剂中，用高电导的电泳缓冲溶液充满毛细管柱，在电动进样模式将样品引入毛细管。在高电压的作用下，因电泳缓冲液与样品溶剂存在电导率差异，因样品溶剂电导率小且处于进样口端，故该处电场强度高于电泳缓冲液灌注的毛细管柱内部电场强度，故在此区域内带负电荷样品的迁移速率快，当待测分析物迁移到样品溶液与电泳缓冲液的交界处，迁移速率由大骤然变小，样品在此处得以富集，浓度提高。

图1　实验中反向电压下，场放大进样毛细管电泳示意图

2.2电泳缓冲液 pH的影响

图2　不同pH对于待测样品的分离影响的毛细管电泳图

实验考察了pH值在7.00～10.75范围内待测组分的分离情况，结果如图 2所示。随着pH值的增大，四种待测组分出峰并逐渐分离，在pH为8.7时，四种样品可以达到完全分离，且系统峰的出峰时间距样品峰出峰时间较远，对样品峰干扰小。若继续加大电泳缓冲液的pH，可发现后两种样品峰混合在一起分离不开。故本实验最佳pH值为8.7。

2.3电泳缓冲液中磷酸盐浓度的优化

缓冲液中磷酸盐的浓度会影响电渗流。实验考察了磷酸盐浓度在17.5～30 mmol/L时对组分分离及峰电流的影响。实验发现，随着磷酸盐浓度的增加，样品峰由混合峰逐渐分离。当磷酸盐浓度为22.5 mmol/L时，所测四种磺胺类药物可以完全分离；当磷酸盐浓度大于22.5 mmol/L时，组分峰电流却呈现下降趋势。所以选择磷酸盐浓度为22.5 mmol/L。

2.4CTAB浓度的优化

CTAB的浓度是影响样品组分分离程度与组分峰电流的重要因素。实验中考察了CTAB浓度在0.2～1.3 mmol/L时对组分峰电流的影响。当CTAB的浓度在0.2～0.6 mmol/L时样品是混合在一起分不开的，当CTAB浓度增加至0.8 mmol/L时，四种磺胺类药物可以完全分离且样品峰电流达到最高值，继续加大CTAB的浓度，组分峰电流呈下降趋势。综上所述，实验选择CTAB浓度为0.8 mmol/L。

2.5电泳溶液中有机溶剂的优化

图3　ACN百分比对组分峰电流的影响

有机溶剂的添加，可以改善电泳缓冲液pH、焦耳热效应等因素对样品组分分离情况的影响，在电泳缓冲液pH为8.70，组成为22.5 mmol/L Na2HPO4-0.9 mmol/L CTAB时，考察了不添加有机物，添加甲醇、乙腈对四种磺胺类药物分离程度及峰型的影响。不添加有机物与加入8%甲醇的体系，四种样品并没有全部出峰，加入8%乙腈的体系，四种待测组份全部出峰且分离，但峰形不好。故本实验选择乙腈为添加的有机溶剂。实验考察了电泳缓冲液中ACN的百分比在2%～20%对组分峰电流的影响，如图3所示。随着ACN浓度的增加，后两个组分峰峰型逐渐尖锐，随着ACN百分比不断的增加，组分峰的拖尾现象逐渐消失，当ACN的百分比达到18%时，四种样品完全分离且无拖尾现象，继续增大ACN的百分比四种样品峰混合在一起。综上所述，本实验选择ACN百分比为18%。

2.6样品溶剂的考察

图4　样品溶剂对富集效果影响的毛细管电泳图

场放大进样的原理是将样品溶于低电导的溶液中，而电泳缓冲液的电导高，因样品区与缓冲液区存在电导差，使得

待测物质的迁移速度由快突然骤减，进而实现样品的富集。本实验分别以水和稀碱作为样品的溶剂，结果如图4所示，当样品溶剂为0.1 mmol/L NaOH时，四种磺胺类药物更易溶于稀碱且峰型较好，综合考虑，本实验的样品溶剂为0.1 mmol/L NaOH溶液。

2.7重现性、线性范围和检出限

在最佳实验条件下，重复5次实验以便于对系统的重现性进行评价。各分析物的峰电流及迁移时间的标准偏差(RSD)如表1所示。结果表明，本实验重现性良好，结果可靠，方法可行。

表1　各分析物峰电流及迁移时间的相对标准偏差(n=5)

在上述实验条件下进样，得到4种磺胺类药物峰电流(y)与浓度(x)的线性回归方程及检出限(三倍噪音法)，如表2所示。

表2　各分析物的线性范围、回归方程、相关系数及检出限

3　结　论

反向电压下毛细管区带电泳联合样品堆积富集技术对四种磺胺类药物的残留进行了分析检测。本实验以22.5 mmol/L磷酸盐为电泳缓冲液体系，CTAB为电渗流改性剂，18%的乙腈为有机添加剂，在最优条件下，对所建立实验方法经行验证，结果表明，本方法方便简单，灵敏度高，对所检测的分析样品有很好选择性。为磺胺类药物的检测提供了一种新的可行性方法。

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[3]王翔,邓晓军,宋国新,等.食品中磺胺类兽药残留前处理技术的研究进展[J].食品科学, 2009, 30(7): 254-257.

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On-line Concentration by Field-enhanced Sample Injection with Reverse Voltage in Capillary Zone Electrophoresis for the Analysis of Sulfonamides

SUNTong,ZHANGYing,WENGQian-feng

(Liaoning Normal University, Liaoning Dalian 116029, China)

A method based on capillary zone electrophoresis combined field-enhanced injection with reverse voltage was developed for the simultaneous determination of sulfonamide antibiotics. Optimized experimental conditions were established as follows: lectrophoresis buffer, 22.5 mmol/L phosphate solution-0.8 mmol/L CTAB at pH 8.70, 18%(V/V) acetonitrile as organic additive, 0.1 mmol/L NaOH as sample solvent, electrophoresis voltage was -20 kV, detect potential was 1.1 V, electrokinetic injection was 20 S at -13 kV. Under the optimum conditions, the limit of detections (LODs) of four kinds of drugs reached to about 10-9～10-10mol/L.

capillary zone electrophoresis; field-enhanced injection; reverse voltage; sulfonamides

孙彤，女，硕士研究生，主要从事毛细管电泳分析研究。

翁前锋。

O657.8

A

1001-9677(2016)012-0130-03