人血清白蛋白对菁染料超分子聚集体的调控研究*

赵丽媛，曹佳佳，杨丹琦，肖情情，王亚男，孙　鑫，陈宏博，兰　玲，张秀凤

(华北理工大学化学工程学院，河北　唐山　063009)



人血清白蛋白对菁染料超分子聚集体的调控研究*

赵丽媛，曹佳佳，杨丹琦，肖情情，王亚男，孙鑫，陈宏博，兰玲，张秀凤

(华北理工大学化学工程学院，河北唐山063009)

采用紫外吸收光谱和荧光光谱研究了菁染料MTC超分子聚集体与人血清白蛋白(HSA)之间的相互作用。研究表明在pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，MTC主要以J-聚集体的形式存在而非单体。当HSA存在时，J-聚集体部分分解转变为H-聚集体。同时，MTC对HSA的内源荧光有较强猝灭作用，猝灭机制属于生成复合物的静态猝灭，二者结合常数为6.86×105M-1，结合位点数为1。MTC的存在导致了色氨酸所处微环境极性增大，疏水性降低，肽链变得更加伸展。

人血清白蛋白；菁染料；聚集体；荧光猝灭

蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构和功能物质，它参与了几乎所有的生命过程。人血清白蛋白(Human Serum Album, HSA)是由585个氨基酸残基组成的单肽链心形蛋白质，分子量约66500，其中约67%的HSA为 α-螺旋结构[1]。HSA主要存在于血浆和组织液中，其浓度达到了40 mg/mL。HSA可以储存和运输许多内源和外源物质(小分子物质)，如胆红素、脂肪酸、激素、阴阳离子、药物、染料、量子点和配合物等[2-3]。进入生物体内的药物要通过血浆的储存和转运到达受体部位发挥药效，所以从分子水平研究药物小分子与蛋白质的相互作用不仅有助于了解药物的储存、转运和代谢过程，也为高活性药物小分子的设计和开发提供了有价值的信息。

菁染料作为一类荧光染料分子，由于其具有光谱范围宽、摩尔消光系数高、高荧光量子产率等优点[4]，因此它不仅在传统的感光、光电领域有广泛应用，在生物医学以及肿瘤治疗方面也体现出广阔的应用前景。在溶液和一些基质中，菁染料分子由于分子骨架及取代基的不同，通过分子间范德华力可以自发的形成多种状态的超分子聚集体，能够以单体、二聚体、H-聚集体和J-聚集体等多种形式存在。菁染料可以以蛋白质、DNA等生物大分子为模板进行超分子组装和调控，用菁染料聚集体设计成探针实现了对HSA可视化和荧光的双重检测。

1　实　验

1.1仪器和试剂

TU-1901型紫外可见吸收光谱仪，北京普析公司；F-7000型荧光光谱仪，上海叶拓仪器仪表有限公司。

菁染料MTC[3，3’-二(3-磺丙基)-4,5,4’,5’-二苯并-9-甲基-噻碳菁染料三乙胺盐(C38H45N3O6S4)]按Hamer[5]和Ficken[6]建议的方法合成，使用前经甲醇重结晶，质量通过核磁共振、质谱、红外光谱和元素分析鉴定，结构如图1所示。

图1　MTC的化学结构示意图

人血清白蛋白(HSA),生物试剂 Sigma公司；盐酸(HCl,分析纯),天津市凯信化学工业有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris),上海晶纯生化科技股份有限公司；实验所用水均为超纯水。

1.2实验方法

1.2.1样品的制备

实验所用Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.4，每升溶液中含有1.211 g Tris)。称量一定量的菁染料MTC用少量甲醇溶解，再用Tris-HCl缓冲溶液稀释到所需体积及浓度得到染料母液。准确称量一定量的HSA样品直接用缓冲溶液稀释成HSA母液，储存于4 ℃冰箱内。将一定体积的人血清白蛋白母液和菁染料MTC溶液混合后用Tris-HCl缓冲溶液定容配制一系列不同浓度比的MTC和HSA混合溶液并摇匀，避光静置2 h后进行光谱试验。

1.2.2光谱实验测定

紫外可见吸收光谱：扫描波长范围为400～800 nm，扫描间隔为1 nm。

荧光光谱：实验中采用的激发光源为氘灯，激发波长分别为280 nm和295 nm，发射波长为300～500 nm，扫描速度2400 nm/min，激发光与发射光的狭缝宽度均设为5 nm，电压为400 V。

2　结果与讨论

2.1MTC-HSA紫外吸收光谱分析

图2　不同浓度的HSA对菁染料MTC的紫外可见吸收光谱

在浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液中，MTC主要以几个或者多个染料分子中的疏水平面堆积在一起形成的J-聚集体形式存在。由图2可知，将HSA加入到MTC自组装形成的J-聚集体中，J-聚集体的吸收值逐渐降低，说明J-聚集体逐渐分解，并以HSA 为模板组装形成了H-聚集体。同时，我们发现即使在高浓度HSA溶液体系中, J-聚集体的吸收峰值虽然较低，但并没有完全消失，说明J-聚集体也不能完全地转化为H-聚集体。一般来说，相邻的菁染料单体分子间在范德华作用力下自组装形成J-聚集体，同HSA相互作用时，由于静电力和疏水作用力而被部分分解，然后以HSA为模板组装成单体或H-聚集体。

2.2MTC对HSA的荧光猝灭

2.2.1荧光猝灭光谱

荧光光谱法是研究小分子配体与蛋白质的相互作用的方法之一。通过荧光光谱研究，可以获得蛋白质与小分子之间结合作用的信息，如结合位点、结合常数、构象变换及作用力类型等。HSA中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸 (Phe) 三种芳香族氨基酸而属于内源性荧光物质[7]。当激发波长为280 nm 时，荧光主要源自Trp和 Tyr残基。而当激发波长为295 nm时，蛋白质荧光主要源自于Trp残基。

由图3可知，在温度293 K，pH=7.4的条件下，随着MTC浓度增大，用280 nm和295 nm波长激发的HSA的荧光强度都逐渐降低，表明MTC和HSA发生了相互作用。同时，在295 nm激发状态下，最大发射波长明显红移，表明MTC与HSA发生了相互作用并且使色氨酸所处环境极性增大，疏水性降低，肽链的伸展程度变大，HSA分子构象发生改变，MTC形成的J-聚集体是在HSA的疏水腔中进行了聚集状态的转变。

图3　不同浓度的菁染料MTC对HSA(5 μM)的荧光发射光谱

2.2.2荧光猝灭机制

荧光猝灭是指荧光物质与猝灭剂之间所发生的导致荧光强度降低的物理或化学作用。基于蛋白质与小分子之间相互作用的荧光猝灭过程，可分为静态猝灭和动态猝灭两种机制。静态猝灭是指荧光体与猝灭剂通过疏水作用、静电作用和氢键等弱作用力结合生成无荧光或荧光强度较低的复合物而导致荧光猝灭的过程。动态猝灭是指猝灭剂和荧光体物质间通过碰撞而使得荧光猝灭的过程。为证实MTC与HSA作用的荧光猝灭过程，将此过程按动态过程处理，根据Stern-Volmer方程[8]：

(1)

式中：F0，F分别为单独HSA和存在不同浓度MTC下荧光发射峰强度；Kq为生物大分子的荧光猝灭速率常数；τ0为无猝灭剂存在的情况下蛋白质的荧光寿命(τ0=10-8s)[9]；[Q]为猝灭剂的浓度；Ksv为动态猝灭常数。

以F0/F对[Q]做线性回归，可得到MTC与HSA作用的Stern-Volmer曲线(图4)。根据猝灭曲线的斜率可得荧光猝灭常数Ksv和猝灭速率常数Kq分别为5.07×104M-1和5.07×1012M-1s-1，猝灭速率常数远大于荧光分子最大扩散控制的碰撞猝灭速率常数2×1010M-1s-1，由此可知，菁染料MTC对HSA荧光猝灭过程不是因分子间碰撞而引起的动态猝灭，而是非荧光复合物形成而产生的静态猝灭过程。

图4　MTC-HSA体系的Stern-Volmer方程拟合图

2.2.3结合常数和结合位点的计算

由于MTC对人血清白蛋白的荧光猝灭是一个静态猝灭过程，小分子与蛋白质之间的结合常数Ka和结合位点数n可由以下公式获得:

(2)

式中，Ka为结合常数；n为结合位点数。以lg[(F0-F)/F]对lg[Q]进行线性拟合，得到荧光猝灭的对数曲线(图5)。由对数曲线的截距和斜率分别可得菁染料MTC与HSA作用的结合常数Ka和结合位点数n值分别为6.86×105M-1和1.24，表明菁染料HSA对MTC具有很强的结合能力，n值近似等于1，说明MTC与HSA形成1:1的复合物，MTC在人血清白蛋白上主要有一个特异性的结合位点。

图5　不同浓度MTC对HSA荧光猝灭的对数曲线

3　结　论

采用紫外吸收光谱研究了HSA对MTC聚集体的调控作用，表明随着HSA浓度的增大，MTC形成的J-聚集体逐渐分解并以HSA为模板组装为H-聚集体。通过荧光光谱研究发现HSA对MTC有较高的亲和力，MTC对HSA的荧光猝灭机制为静态猝灭过程。MTC在HSA上主要存在一个特异性结合位点，形成1:1的复合物。同时，MTC的加入导致了色氨酸所处微环境极性增大，疏水性降低，肽链的伸展程度变大，蛋白质结构变得更加疏松。

[1]唐江宏.有机小分子与人体血清蛋白的相互作用研究[D].兰州:兰州大学, 2006.

[2]王宁,刘忠英,胡秀丽,等.黄芩类药物与人血清白蛋白的相互作用[J]. 高等学校化学学报,2011,32(2):241-245.

[3]Xu TC, Guo XJ, Zhang L, et al.Multiple spectroscopic studies on the interaction between olaquindox, a feed additive,and bovine serum albumin[J].Food.Chem.Toxicol,2012, 50:2540-2546

[4]张亚洲.菁染料的超分子组装及手性诱导研究[D].北京:中国科学院研究生院,2007.

[5]Hamer F M. The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Interscience[M].New York, 1964: 148-200.

[6]Ficken G E. The Chemistry of Synthetic Dyes[M]. Academic Press New York, 1971: 228-240.

[7]尹燕霞,向本琼,佟丽.荧光光谱法在蛋白质研究中的应用[J].实验技术与管理,2010,27(2):34-37.

[8]张冰卫,李博,夏文水,等.用荧光光谱法研究分子间结合常数和结合位点数时的公式选择[J].药学进展,2011,35(7)： 296-303.

[9]吴根华,汪婕,陈金龙,等.荧光光谱法研究锌(Ⅱ)存在下诺氟沙星与牛血清白蛋白的结合作用[J].光谱学与光谱分析,2008,28(4):913-916.

Investigation on the Supramolecular Regulation of Cyanine Dyes by Human Serum Albumin*

ZHAOLi-yuan,CAOJia-jia,YANGDan-qi,XIAOQing-qing,WANGYa-nan,SUNXin,CHENHong-bo,LANLing,ZHANGXiu-feng

(College of Chemical Engineering, North China University of Science and Technology, Hebei Tangshan 063009, China)

The interaction of human serum albumin (HSA) and aggregation of cyanine dye MTC was studied using UV absorption and fluorescence spectroscopy. The research showed that MTC existed not as isolated monomer but rather in the formation of J-aggregation in the pH 7.4 Tris-HCl buffer system. In the presence of HSA, the J-aggregation was partially transformed into H-aggregation. Meanwhile, there was a strong fluorescence quenching of HSA by MTC. The quenching mechanism was a static quenching by forming the HSA-MTC complex. The binding constant Kaand the number of binding site were 6.86×105M-1and 1, respectively. The presence of MTC led to the hydrophobic nature around tryptophan residue of HSA become smaller, polarity would increase and the peptides became more stretched.

human serum albumin; cyanine dye; aggregation; fluorescence quenching

华北理工大学化学工程学院大学生创新创业训练计划项目(2015HG03)。

赵丽媛(1994-)。女。

张秀凤(1978-)，女，博士，华北理工大学化学工程学院教授，研究方向为载药体系研究。

O657.3

A

1001-9677(2016)012-0087-03