力学环境对骨折早期骨折端间充质干细胞募集的影响

李颖　黎立　李俊玲　刘效敏　岳龙涛　张俊忠　王世立

【摘要】　目的　探究骨折早期力学环境对骨折端间充质干细胞(MSC)募集的影响。方法　建立大鼠股骨骨折模型，以不同刚度系数的外固定架予以固定，分为对照组(超高刚度外固定架组)、高刚度外固定架组和低刚度外固定架组。术后当天和2周摄X线片，观察骨痂及骨折愈合情况。术后2、4、6、10 d取骨折端组织，分离有核细胞，流式细胞术检测CD29+CD90+ 细胞占有核细胞比例。计算骨折端MSC绝对数量。结果　X线检查显示，术后2周高刚度外固定架组骨痂量明显少于低刚度外固定架组。术后2、4、6、10 d各组CD29+CD90+细胞数量逐渐减少(P<0.05)；术后2、4、6、10 d低刚度外固定架组CD29+CD90+细胞数量大于高刚度外固定架组(P<0.05)，且低、高刚度外固定架组CD29+CD90+细胞数量均大于对照组(P<0.05)。结论　力学环境会影响骨折区MSC募集，微动可促进骨折愈合。



·实验研究·

力学环境对骨折早期骨折端间充质干细胞募集的影响

李颖黎立李俊玲刘效敏岳龙涛张俊忠王世立

【摘要】目的探究骨折早期力学环境对骨折端间充质干细胞(MSC)募集的影响。方法建立大鼠股骨骨折模型，以不同刚度系数的外固定架予以固定，分为对照组(超高刚度外固定架组)、高刚度外固定架组和低刚度外固定架组。术后当天和2周摄X线片，观察骨痂及骨折愈合情况。术后2、4、6、10 d取骨折端组织，分离有核细胞，流式细胞术检测CD29+CD90+ 细胞占有核细胞比例。计算骨折端MSC绝对数量。结果X线检查显示，术后2周高刚度外固定架组骨痂量明显少于低刚度外固定架组。术后2、4、6、10 d各组CD29+CD90+细胞数量逐渐减少(P<0.05)；术后2、4、6、10 d低刚度外固定架组CD29+CD90+细胞数量大于高刚度外固定架组(P<0.05)，且低、高刚度外固定架组CD29+CD90+细胞数量均大于对照组(P<0.05)。结论力学环境会影响骨折区MSC募集，微动可促进骨折愈合。

力学环境；骨折愈合；干细胞；募集

骨折愈合主要生物学演变过程包括炎症阶段、软骨形成阶段及骨修复阶段。骨折愈合影响因素众多，其中骨折区力学环境是重要因素。研究[1]报道，适度固定骨折可诱发骨折端细微运动，刺激骨痂生长，从而加速骨折愈合过程。但目前对于力学环境影响骨折愈合过程的细胞生物学和分子生物学机制仍不甚清楚。有研究[2-4]显示，力学环境对骨折愈合的影响与骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等分泌有关。我们在临床治疗中发现，骨折完全固定并不能加速骨折痊愈，而适当给予一定的活动量却可加速骨折愈合及肢体功能恢复[5]。因此，研究骨折端力学环境对骨折愈合过程的影响，对于探讨骨折愈合机制，进而指导临床骨折治疗具有重要意义。

间充质干细胞(MSC)为来源于中胚层、具有多向分化潜能的成体干细胞，能向成骨细胞、成软骨细胞等方向分化。骨折损伤部位MSC募集在骨修复过程中发挥重要作用，骨折端募集足够数量的MSC是骨折愈合的前提条件和细胞学基础[6]。但不同力学环境是否对骨折端MSC募集有影响，尚未见报道。骨折早期是力学刺激促进骨折愈合最有效的时期[7]，本实验以股骨骨折大鼠为模型，用不同刚度系数的外固定架予以固定，以给予骨折端不同的力学环境，观察骨折愈合早期不同力学环境对骨折端MSC募集的影响。

1　 材料与方法

1.1实验动物及材料

实验动物：雄性SD大鼠，体重280～300 g，SPF级，购自山东鲁抗医药股份有限公司。

主要试剂与器材：Ficoll分离液(美国GE医疗公司)，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，兔抗大鼠单克隆抗体CD29-FITC、CD90-PE(美国Abcam公司)，荧光70 μm细胞滤器(美国Corning公司)。

实验仪器：显微镜(日本Nikon公司)，台式离心机(飞鸽TDL-40B)，生物力学测试机(MTS-858 Mini Bionix)，流式细胞仪(BD FACS Aria Ⅱ)。

1.2实验方法

1.2.1制备实验动物模型

将体重280～300 g的雄性SD大鼠随机分为对照组(超高刚度外固定架组)、高刚度外固定架组、低刚度外固定架组。外固定架的刚度系数不同，其对骨折区施加的力学环境也不同。手术过程：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠(30 mg/kg)，将其腹面朝下固定于手术台，右侧大腿外侧剃毛、碘伏消毒，常规消毒铺巾，切开右侧大腿处皮肤、皮下组织及深筋膜，从浅层股肌与股二头肌之间的外侧肌间隙钝性分离进入并暴露股骨干。各组分别用超高、高、低刚度外固定架固定股骨。外固定架(图1)均由4枚钢针和固定钢针的横梁组成，长、宽、高分别为20、5.5、6 mm，相邻钢针之间的距离为5 mm，超高、高、低刚度外固定架固定钢针直径分别为1.2、1.0、0.5 mm，外固定架横梁材料为高分子聚乙烯医用材料。固定完成后用小钢锯、剪刀制作1 mm的骨缺损作为骨折区。缝合肌肉、皮肤，完成后使大鼠自由活动。术后3 d内肌肉注射头孢唑啉钠(30 mg/kg)以防细菌感染，钢钉处常规消毒。实验中所有大鼠均为右侧股骨单侧造模。

图1　外固定架固定大鼠股骨骨折模型示意图

对经外固定架固定的股骨进行生物力学测试，超高、高、低刚度外固定架刚度系数分别为60.6、18.2、8.5 N/mm(刚度系数为断端活动1 mm所需力的大小)。

1.2.2影像学观察骨折愈合情况

术后当天、2周分别对高、低刚度外固定架组摄X线片，观察2周后高、低刚度外固定架固定下股骨骨折愈合情况。

1.2.3骨折区有核细胞计数与分析

各组大鼠均分别在术后2、4、6、10 d腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠(60 mg/kg)处死大鼠。用手术剪和手术刀分离损伤部位皮肤与肌肉，去除外固定架，用髓核钳将骨折端组织取出，取材部位为中间2根钢钉之间的断端组织，称取200 mg断端组织置于有DMEM培养基的无菌培养皿，并剪碎混匀，经70 μm细胞滤器倒入50 mL离心管，收集离心管中的细胞悬液。采用密度梯度离心法将细胞悬液按1∶1加至Ficoll有核细胞分离液上层，1800 rpm/min离心35 min，吸取中间层云雾状细胞层。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，并进行细胞计数。

以PBS为空白对照，将收集的细胞PBS洗涤1次，加入单克隆抗体CD90-FITC、CD29-PE[8]，工作浓度为1∶10，4 ℃，避光，孵育20 min，PBS洗涤2次。经流式细胞仪检测CD29+CD90+细胞占有核细胞比例。

根据以上结果，计算MSC绝对数量，公式为：MSC绝对数量=骨折区有核细胞数量×CD29+CD90+细胞占有核细胞比例。

1.3统计学分析

2　结果

2.1动物建模情况

实验分为对照组、高刚度外固定架组、低刚度外固定架组，共造模51只，3只麻醉过深死亡，无感染发生，每组各16只。术后1～2 h大鼠自然苏醒，蜷缩患肢活动，术后1 d患肢站立，术后2 d骨折区形成血肿，尚未有软骨生成，术后4 d血肿明显减少，术后6 d出现少量软骨，术后10 d生成软骨较之前增多，出现部分断端软骨连接，尚未有骨性连接发生，且低刚度外固定架组软骨数量明显多于高刚度外固定架组，而高刚度外固定架组软骨数量多于对照组。

2.2影像学结果

术后当天和2周对高、低刚度外固定架组摄X线片(图2)。术后2周低刚度外固定架组骨痂量明显多于高刚度外固定架组，表明低刚度外固定架组骨折愈合速度较快，微动可促进骨痂形成，加速骨折愈合。

图2术后当日和2周高、低刚度外固定架组X线片a. 术后当天高刚度外固定架组X线片b. 术后2周高刚度外固定架组X线片c. 术后当天低刚度外固定架组X线片 d. 术后2周低刚度外固定架组X线片

2.3有核细胞计数

随着骨折愈合时间的延长，各组骨折端分离得到的有核细胞数均减少。术后2、4、6、8 d低刚度外固定架组骨折端有核细胞数量多于高刚度外固定架组，高刚度外固定架组骨折端有核细胞数量多于对照组(表1)。

表1　术后骨折端有核细胞计数(×105)()

*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01；#表示与高刚度外固定架组相比，P<0.05；##表示与高刚度外固定架组相比，P<0.01

2.4MSC检测结果

流式细胞术检测CD29+CD90+细胞占有核细胞比例，结果对照组术后2 d CD29+CD90+细胞占有核细胞比例为7.1%，术后10 d为0.9%，高刚度外固定架组术后2 d CD29+CD90+细胞占有核细胞比例为8.3%，术后10 d为2.7%，低刚度外固定架组术后2 d CD29+CD90+细胞占有核细胞比例为9.8%，术后10 d为4.0%(图3)。随着骨折愈合时间的延长，各组CD29+CD90+细胞占有核细胞比例均减少；术后2、4、6、10 d低刚度外固定架组CD29+CD90+细胞占有核细胞比例大于高刚度外固定架组(P<0.05)，而高刚度外固定架组CD29+CD90+细胞占有核细胞比例大于对照组(P<0.05)。

2.5MSC绝对数量

根据骨折端有核细胞数量及MSC占有核细胞比例计算出骨折端MSC绝对数量，结果如图4所示。术后2、4、6、10 d高、低刚度外固定架组MSC绝对数量均显著高于对照组；术后2、4、6、10 d低刚度外固定架组MSC绝对数量均高于高刚度外固定架组。

3　讨论

骨折愈合是复杂的病理生理过程，涉及多种细胞及细胞因子共同作用，影响骨折愈合的因素也是多方面的，其中骨折区力学环境是重要因素。骨折端恰当的轻微运动可促进骨痂形成与钙化，加速骨折愈合[9]。但目前对于轻微运动促进骨痂的作用机制仍不清楚。

图3　流式细胞术检测CD29+CD90+细胞占有核细胞比例

图4　MSC绝对数量

*表示与对照组相比，P<0.05;**表示与对照组相比，P<0.01;#表示与高刚度外固定架组相比，P<0.05;##表示与高刚度外固定架组相比，P<0.01

诱发微动主要有主动方式和被动方式。主动方式是通过肢体负重作用于内、外固定物而产生微动[10-11]。被动方式是通过外在施加载荷产生骨折端微动[12]。主动方式的优势在于能更真实地模拟体内力学环境。本实验采用主动方式，使用不同刚度系数的外固定架固定大鼠骨折处，继而通过肢体负重产生不同程度的微动。

对于微动促进骨折愈合的细胞及分子生物学机制，目前尚无确切结论。参与骨生成的细胞和分子较为广泛[13]，包括基质细胞系统来源的成骨细胞、MSC、内皮细胞、网状细胞、成纤维细胞和造血系统来源的单核细胞、破骨细胞，相关分子包括骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等。对于这些相关细胞及细胞因子在微动促进骨折愈合中的作用，目前有以下观点：微动造成二次创伤，延长了骨折修复炎症期，促进局部血供增加；骨细胞可以感受机械应力的刺激，增加骨细胞、成骨细胞等代谢活性，促进骨形成；微动可以提高骨形态发生蛋白[2]、成纤维细胞生长因子[3]、血管内皮生长因子[4]的表达水平，从而促进骨修复。而MSC在骨折愈合过程中起重要作用逐渐被广泛认可，但力学环境对骨折愈合的影响与MSC是否有关，尚无相关理论依据。

本实验中影像学检查显示，低刚度外固定架组骨痂量较高刚度外固定架组多，证明微动可加速骨折愈合。而骨折端MSC数量检测结果表明，骨折愈合早期若给予骨折区活动系数较大的固定，骨折端迁移进入的MSC数量相应增加。可见，骨折端力学环境可影响骨折端MSC的募集，进一步影响骨折愈合。

骨折损伤部位的MSC来自于周围组织和血循环中[14]，当骨骼受损时，一系列特殊分子在受损部位释放并进入血循环，使得受损组织及血循环中的MSC迁移至受损部位并向特定组织分化[14-15]。近年来，SDF-1/CXCR4在骨折愈合及MSC迁移过程中的作用逐渐被揭示。Granero-Molto等[16]研究发现，只有表达CXCR4的MSC才会迁移到骨折部位，而不表达CXCR4的MSC则无法向骨折区聚集。由此，我们推测微动可能促进了某些与MSC迁移相关的分子如SDF-1及CXCR4在损伤部位的释放或表达，从而促进MSC迁移至骨折区，由此促进骨折愈合。但目前对于力学环境影响骨折区MSC募集的具体机制及其涉及的相关信号通路，尚需进一步研究。

此外，实验过程中我们观察到术后6 d各组骨折区均有软骨生成，表明MSC已部分分化为软骨细胞，但肉眼观察到各组生成的软骨量及后续软骨内成骨的进度均不同步，那么是否在骨折愈合早期不同力学环境下骨折端MSC向成骨、成软骨细胞的分化存在差异，也值得进一步探讨。

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(收稿：2016-01-25; 修回：2016-03-22)

(本文编辑：卢千语)

Effect of mechanical environment on recruitment of mesenchymal stem cells at fracture site during early stage of fracture healing

LI Ying1,2, LI Li3, LI Jun-ling1,2, LIU Xiao-min3, YUE Long-tao4, ZHANG Jun-zhong3, WANG Shi-li1,2.

School of Medical and Life Science, University of Jinan and Shandong Academy of Medical Science1, Jinan 250022, China; Medical Biotechnology Center, Shandong Academy of Medical Sciences2, Jinan 250062, China; Department of Orthopaedic, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine3, Jinan 250011, China; Central Laboratory, Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University4, Jinan 250062, China

Correspondingauthor:ZHANGJun-zhongE-mail:caohui63@163.com

WANGShi-liE-mail:shili2005@sina.com

ObjectiveTo explore the influence of mechanical environment on recruitment of mesenchymal stem cells (MSCs) at fracture site during early stage of fracture healing. Methods The rat femur fracture models were established, and fixed with external fixator of different stiffness coefficient. They were divided into control group with super-high stiffness external fixation, high stiffness fixator group and low stiffness fixator group. The bone callus and the degree of fracture healing were observed by X-ray after two weeks. The tissues of fracture site were obtained at 2, 4, 6, 10 days after surgery. The nucleated cells were isolated, and the ratio of CD29+CD90+ cells was detected by flow cytometry. Results According to the X-ray results, the amount of callus of high stiffness fixator group was significantly less than that of low stiffness fixator group. The ratio of CD29+CD90+ cells of three groups decreased with the increasing of healing time (P<0.05). The ratio of CD29+CD90+ cells of low stiffness fixator group was higher than that of high stiffness fixator group, while that of control group was lowest level (P<0.05). Conclusion The recruitment of MSCs at fracture site could be affected by the mechanical environment, and subtle movement could promote fracture healing.

Mechanical environment; Fracture healing; Mesenchymal stem cells; Recruitment

国家自然科学基金(81373661)、山东省科技发展计划项目(2013G0021806)

250022， 济南大学、山东省医学科学院医学与生命科学学院(李颖、李俊玲、王世立)；250062济南，山东省医学科学院山东省医药生物技术研究中心(李颖、李俊玲、王世立)；250011济南， 山东中医药大学附属医院运动损伤骨科(黎立、刘效敏、张俊忠)；250062济南，山东大学附属千佛山医院中心实验室(岳龙涛)

张俊忠E-mail: caohui63@163.com

王世立E-mail: shili2005@sina.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.03.016