锂介导的Wnt/β-catenin信号转导通路对骨髓间充质干细胞的影响

翁诗阳　朱振中　汤春　张长青



锂介导的Wnt/β-catenin信号转导通路对骨髓间充质干细胞的影响

翁诗阳朱振中汤春张长青

人类骨髓间充质干细胞来源于胚胎时期的中胚层，存在于骨髓、脂肪、皮肤等组织中，具有自我更新能力及多向分化潜能。研究表明，锂剂可激活Wnt/β-catenin信号转导通路而对骨髓间充质干细胞增殖、分化等产生影响。该文就锂介导的Wnt/β-catenin信号转导通路对骨髓间充质干细胞的影响作一综述。

骨髓间充质干细胞；锂剂；Wnt/β-catenin信号转导通路

锂剂是治疗抑郁症和造血系统疾病最有效的药物之一[1]，它还对神经退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森病导致的脑损伤有明显保护作用。大量研究表明，锂剂可激活Wnt/β-catenin信号转导通路[2]，Wnt/β-catenin信号转导通路对骨髓间充质干细胞增殖与分化起着举足轻重的作用[3]，人类骨髓间充质干细胞来源于胚胎时期的中胚层，存在于骨髓、脂肪、皮肤等组织中，具有自我更新能力及多向分化潜能，它在体外易分离获得，并可通过特定的方法诱导成为各种组织细胞[4]。锂剂是否可以通过Wnt/β-catenin信号转导通路调控骨髓间充质干细胞增殖及分化，从而促进骨坏死的自我修复，近年来学者们对此进行了许多研究。

1　锂剂与Wnt/β-catenin信号转导通路

锂剂可以通过调控糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)影响Wnt/β-catenin信号转导通路。GSK-3β是胞内活跃的丝/苏氨酸激酶，担负着某些重要蛋白如Wnt/β-catenin信号转导通路转录因子β-catenin磷酸化功能。正常情况下，Wnt/β-catenin信号转导通路主要依靠β-catenin稳定表达，β-catenin由GSK-3β磷酸化，随后由泛素-蛋白酶体复合物降解而清除。研究表明，锂剂可以通过抑制GSK-3β激活Wnt/β-catenin信号转导通路[5]，其机制为锂剂与镁离子竞争性结合GSK-3β而直接发挥抑制作用，或通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)、蛋白激酶B1(Akt1)增强GSK-3β磷酸化作用[6]。理论上锂剂抑制GSK-3β活性可造成胞质内β-catenin的蓄积，从而引起Wnt/β-catenin信号转导通路的激活。有学者[7]实验研究发现，锂剂可上调β-catenin蛋白表达，造成Wnt下游基因如Axin2、Ahr及Nkd2表达上调，从而激活Wnt/β-catenin信号转导通路。

2　Wnt/β-catenin信号转导通路与骨髓间充质干细胞

Wnt/β-catenin信号转导通路对于骨骼系统发育、骨形成、骨愈合、骨代谢平衡调节起着重要作用[8]，对骨髓间充质干细胞也有重要影响，骨髓间充质干细胞分化由信号通路调控，其中Wnt/β-catenin信号转导通路是调控骨髓间充质干细胞的主要信号通路之一，可在胚胎早期诱导骨髓间充质干细胞成骨分化。研究[9]表明，肿瘤坏死因子通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化并抑制其成脂分化，从而缓解骨质疏松。Weivoda等[10]研究表明，Wnt/β-catenin信号转导通路可通过激活经典及非经典环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号转导通路抑制破骨细胞分化，使体内骨吸收减少，骨量上升。Wnt/β-catenin信号转导通路是调控骨髓间充质干细胞增殖及分化的枢纽，而其上游的GSK-3β则是该作用的开关。锂剂凭借其组织分布特点在骨组织特异性聚集，抑制GSK-3β表达，从而维持骨髓间充质干细胞增殖与分化，达到修复骨缺损的作用。

3　锂剂对骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响

经典的Wnt/β-catenin信号转导通路可促进骨髓间充质干细胞增殖并抑制其凋亡，而锂剂也有相同作用。体外研究表明，锂剂可调节骨髓间充质干细胞增殖。Zhu等[11]在实验中将骨髓间充质干细胞分为两组，实验组加入5 μm 氯化锂，空白组中不加氯化锂，3 d后使用CCK-8检测细胞增殖情况，发现与对照组相比，实验组细胞数量明显上升，以上作用在使用siRNA或β-catenin抑制剂Quercetin阻断Wnt/β-catenin信号转导通路后消失，表明锂剂可促进人类骨髓间充质干细胞增殖。高丽娜等[12]的实验表明，在人类骨髓间充质干细胞培养基中加入不同浓度的氯化锂(5、10、20、40 mmol/L)后，通过MTT方法检测细胞增殖情况，发现小剂量锂剂(5 mmol/L)可促进骨髓间充质干细胞增殖,而大剂量锂剂(20、40 mmol/L)则会抑制骨髓间充质干细胞增殖。Dong等[13]应用免疫荧光法发现，低浓度氯化锂(0.1 mmol/L)可促进骨髓间充质干细胞增殖并分化为神经细胞。

此外，锂剂还可影响骨髓间充质干细胞凋亡。研究[11]报道，采用5 mmol/L锂剂干扰骨髓间充质干细胞，4 d后使用流式细胞仪膜联蛋白V与碘化丙啶标记法检测发现，锂剂组骨髓间充质干细胞凋亡比例(6.9%)小于空白组(7.2%)。然而，当锂剂剂量达到10 mmol/L时，骨髓间充质干细胞凋亡率明显上升，这可能是由于高浓度锂剂会产生细胞毒性的缘故。

4　锂剂对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

Wnt/β-catenin信号转导通路可调控骨髓间充质干细胞分化方向，锂剂同样可以对体外骨髓间充质干细胞分化产生影响。Yu等[14]使用不同浓度氯化锂(1、5、10、20 mmol/L)干预小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化，21 d后通过聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹技术法检测骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(RUNX2)等成骨指标，发现5 mmol/L氯化锂可使细胞成骨特异性指标表达上升，茜素红染色显示钙结节数目上升，表明锂剂可增加骨髓间充质干细胞成骨能力；在使用Quercetin阻断Wnt/β-catenin信号转导通路后骨髓间充质干细胞促成骨作用消失。有研究[6]使用不同浓度的锂剂干预骨髓间充质干细胞成骨分化，7、14 d后使用逆转录PCR 检测成骨特异性蛋白OCN、RUNX2及碱性磷酸酶表达，发现实验组骨相关基因碱性磷酸酶、RUNX2、OCN表达水平均较空白组高，且呈浓度和时间依赖性。

5　锂剂对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

Tang等[15]研究表明，使用锂剂干扰人类骨髓间充质干细胞成脂分化，21 d后经油红染色观察细胞内脂滴数量，发现与对照组相比，锂剂组脂滴数量明显下降，此外锂剂组成脂肪相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达下降，认为锂剂可抑制骨髓间充质干细胞成脂分化。Visweswaran 等[16]的实验表明，使用锂剂刺激骨髓间充质干细胞成脂分化后，油红染色显示与空白组相比，实验组脂滴数量明显减少，同时成脂特异性蛋白、PPARγ、CAAT区/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和乙酰辅酶A羧化酶表达明显下降，骨髓间充质干细胞成脂分化受抑制。Zhang等[17]使用组织蛋白酶B阻断Wnt/β-catenin信号转导通路，结果锂剂对骨髓间充质干细胞成脂分化的抑制作用消失，表明锂剂抑制骨髓间充质干细胞成脂分化由Wnt/β-catenin信号转导通路介导，且是可逆的。

6　锂剂对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

锂剂可影响骨髓间充质干细胞成软骨分化。Eslaminejad等[18]研究表明，使用锂剂5 mmol/L激活Wnt/β-catenin信号转导通路后，骨髓间充质干细胞成软骨分化增加， 21 d后软骨相关基因Sox9及聚蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白表达上调，表明低浓度锂剂可促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。然而，Kapadia等[19]的研究则发现15 mmol/L锂剂可对大鼠胚胎细胞软骨内骨化产生抑制作用。Kawata等[20]的实验结果也得出相似结论，即小剂量锂剂可促进骨髓间充质干细胞成软骨分化，而大剂量锂剂则抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化。

7　锂剂治疗骨坏死

骨髓间充质干细胞的存在对骨的生长发育及自我修复有很大作用[21-22]，是骨骼系统再生和修复的重要动力，骨髓间充质干细胞的缺失很可能导致骨细胞凋亡、骨坏死及骨自我修复障碍。骨髓间充质干细胞成脂分化与成骨分化在一定水平上保持平衡，打破这种平衡会导致骨髓间充质干细胞增殖能力下降，成骨细胞分化减少，破骨细胞数量上升及生存周期延长，成脂能力增加，成血管能力下降，组织学上表现为骨小梁吸收、股骨头塌陷及微骨折形成[23]，股骨头静脉压力增高，组织缺血。

骨坏死患者体内骨髓间充质干细胞数量下降，成脂分化增多，成骨分化减少，造成再生动力不足，再生方向改变，两者结合导致骨坏死发生。基于此，有研究[24-26]尝试将外源性骨髓间充质干细胞移植到股骨头坏死或骨不连部位，以补充病变处骨髓间充质干细胞数量。然而，外源性骨髓间充质干细胞移植治疗只能在确诊相应疾病的情况下进行，治疗时机相对滞后，且该方法需涉及骨髓间充质干细胞体外分离和培养，手术所带来的并发症也无法避免。目前临床上外源性骨髓间充质干细胞移植治疗骨坏死尚缺乏安全性及有效性全面评估，因此如何通过合理有效的手段激活内源性骨髓间充质干细胞，针对致病因素合理调控骨髓间充质干细胞增殖及分化，达到对抗外界不利因素及促进局部细胞、组织结构再生及功能重建的目的，是目前干细胞治疗研究领域的新理念[27]。

锂剂是一种治疗躁狂、双向情感障碍等精神疾病的常用药物，大多数患者经治疗有显著改善，早在1974年就有学者对锂剂的药理学展开研究[28]。研究发现，抑郁症患者局部神经干细胞增殖能力下降，神经元分化减少。而锂剂可明显提高该区域神经干细胞级神经元数量。随后的体外实验[29]证实，锂剂对神经干细胞增殖及分化都有显著的调控作用。那么锂剂是否对骨坏死区域骨髓间充质干细胞也能发挥相同作用，值得进一步研究。

Wnt/β-catenin信号转导通路在骨骼系统发育及成年后骨代谢平衡调节中发挥重要作用。该信号通路可促进骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化和成软骨分化，减少破骨细胞生成。研究[30]表明，糖皮质激素通过激活GSK-3β抑制Wnt/β-catenin信号转导通路，此为激素性股骨头坏死可能的分子学机制之一。基于此机制，锂剂可拮抗激素作用并预防激素性股骨头坏死[31]。众多研究表明，低浓度锂剂可通过激活Wnt/β-catenin信号转导通路增加骨髓间充质干细胞增殖能力，并促进其数量明显上升，从而使骨再生动力增加；锂剂可明显影响骨髓间充质干细胞分化，促进其成骨分化，抑制其成脂分化，从而造成骨再生方向改变，其综合作用有助于修复骨缺损。然而，目前临床上尚缺乏使用锂剂治疗股骨头坏死、骨不连等报道。使用锂剂治疗骨坏死是否有效，仍需大量动物实验及临床数据支持。

8　结语

近年来有许多动物实验使用锂剂促进小鼠骨形成[32]、改善骨质疏松[33]，增加大鼠骨密度[34]，为锂剂治疗骨坏死提供了良好的理论基础。长期服用锂剂是否引起骨骼系统不良反应如可能致癌[35]并引起多器官病变[36]，使用锂剂治疗骨科疾病的有效剂量，如何控制锂剂局部浓度，锂剂导致的骨量增加、骨密度上升、骨髓间充质干细胞增殖能力增强及分化方向改变是否可逆，停药后是否会复发，都需要大量研究进行探索。

[1]Loebel A, Cucchiaro J, Silva R, et al. Lurasidone as adjunctive therapy with lithium or valproate for the treatment of bipolar Ⅰ depression: a randomized, double-blind, placebo-controlled study[J]. Am J Psychiatry, 2014, 171(2):169-177.

[2]Zhu Z, Kremer P, Tadmori I, et al. Lithium suppresses astrogliogenesis by neural stem and progenitor cells by inhibiting STAT3 pathway independently of glycogen synthase kinase 3 beta[J]. PLoS One, 2011, 6(9):e23341.

[3]Tao K, Xiao D, Weng J, et al. Berberine promotes bone marrow-derived mesenchymal stem cells osteogenic differentiation via canonical Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Toxicol Lett, 2016, 240(1):68-80.

[4]Ma X, Sun Y, Cheng X, et al. Repair of osteochondral defects by mosaicplasty and allogeneic BMSCs transplantation[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(4):6053-6059.

[5]Ferensztajn-Rochowiak E, Rybakowski JK. The effect of lithium on hematopoietic, mesenchymal and neural stem cells[J]. Pharmacol Rep, 2016，68(2):224-230.

[6]Tian N, Kanno T, Jin Y, et al. Lithium potentiates GSK-3β activity by inhibiting phosphoinositide 3-kinase-mediated Akt phosphorylation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 450(1):746-749.

[7]Cuesta S, Severin MJ, Batuecas J, et al. Wnt/β-catenin pathway in the prefrontal cortex is required for cocaine-induced neuroadaptations[J]. Addict Biol, 2016, [Epub ahead of print].

[8]Vriend J, Reiter RJ. Melatonin, bone regulation and the ubiquitin-proteasome connection: a review[J]. Life Sci, 2016, 145:152-160.

[9]Sang C, Zhang Y, Chen F, et al. Tumor necrosis factor alpha suppresses osteogenic differentiation of MSCs by inhibiting semaphorin 3B via Wnt/β-catenin signaling in estrogen-deficiency induced osteoporosis[J]. Bone, 2016， 84: 78-87.

[10]Weivoda MM, Ruan M, Hachfeld CM, et al. Wnt signaling inhibits osteoclast differentiation by activating canonical and noncanonical cAMP/PKA pathways[J]. J Bone Miner Res, 2016, 31(1):65-75.

[11]Zhu Z, Yin J, Guan J, et al. Lithium stimulates human bone marrow derived mesenchymal stem cell proliferation through GSK-3β-dependent β-catenin/Wnt pathway activation[J]. FEBS J, 2014, 281(23):5371-5389.

[12]高丽娜,安莹,杨昊,等. 氯化锂对人颌骨来源的骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化能力的影响[J]. 实用口腔医学杂志, 2013, 29(2):203-208.

[13]Dong BT, Tu GJ, Han YX, et al. Lithium enhanced cell proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells to neural cells in rat spinal cord[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(3):2473-2483.

[14]Yu Z, Fan L, Li J, et al. Lithium chloride attenuates the abnormal osteogenic/adipogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells obtained from rats with steroid-related osteonecrosis by activating the β-catenin pathway[J]. Int J Mol Med, 2015, 36(5):1264-1272.

[15]Tang L, Chen Y, Pei F, et al. Lithium chloride modulates adipogenesis and osteogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 37(1):143-152.

[16]Visweswaran M, Schiefer L, Arfuso F, et al. Wnt antagonist secreted frizzled-related protein 4 upregulates adipogenic differentiation in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J]. PLoS One, 2015, 10(2):e0118005.

[17]Zhang ZY, Mai Y, Yang H, et al. CTSB promotes porcine preadipocytes differentiation by degrading fibronectin and attenuating the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 395(1-2):53-64.

[18]Eslaminejad MB, Karimi N, Shahhoseini M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated by GSK-3 inhibitors[J]. Histochem Cell Biol, 2013，140(6):623-633.

[19]Kapadia RM, Guntur AR, Reinhold MI, et al. Glycogen synthase kinase 3 controls endochondral bone development: contribution of fibroblast growth factor 18[J]. Dev Biol, 2005, 285(2):496-507.

[20]Kawata K, Kubota S, Eguchi T, et al. Role of the low-density lipoprotein receptor-related protein-1 in regulation of chondrocyte differentiation[J]. J Cell Physiol, 2010, 222(1):138-148.

[21]Lebouvier A, Poignard A, Cavet M, et al. Development of a simple procedure for the treatment of femoral head osteonecrosis with intra-osseous injection of bone marrow mesenchymal stromal cells: study of their biodistribution in the early time points after injection[J]. Stem cell Res Ther, 2015, 6:68.

[22]Ma XW, Cui DP, Zhao DW. Vascular endothelial growth factor/bone morphogenetic protein-2 bone marrow combined modification of the mesenchymal stem cells to repair the avascular necrosis of the femoral head[J]. Int J Clin Exp Med, 2015, 8(9):15528-15534.

[23]Jones LC, Hungerford DS. Osteonecrosis: etiology, diagnosis, and treatment[J]. Curr Opin Rheumatol, 2004, 16(4):443-449.

[24]Persiani P, De Cristo C, Graci J, et al. Stage-related results in treatment of hip osteonecrosis with core-decompression and autologous mesenchymal stem cells[J]. Acta Orthop Belg, 2015, 81(3):406-412.

[25]Gomez-Barrena E, Rosset P, Lozano D, et al. Bone fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions[J]. Bone, 2015, 70:93-101.

[26]Pan ZM, Zhang Y, Cheng XG, et al. Treatment of femoral head necrosis with bone marrow mesenchymal stem cells expressing inducible hepatocyte growth factor[J]. Am J Ther, 2015, [Epub ahead of print].

[27]VandenBerg-Foels WS. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2014, 20(1):28-39.

[28]Ebadi MS, Simmons VJ, Hendrickson MJ, et al. Pharmacokinetics of lithium and its regional distribution in rat brain[J]. Eur J Pharmacol, 1974, 27(3):324-329.

[29]Yoneyama M, Shiba T, Hasebe S, et al. Lithium promotes neuronal repair and ameliorates depression-like behavior following trimethyltin-induced neuronal loss in the dentate gyrus[J]. PLoS One, 2014, 9(2):e87953.

[30]Ngkelo A, Hoffmann RF, Durham AL, et al. Glycogen synthase kinase-3β modulation of glucocorticoid responsiveness in COPD[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2015, 309(10):L1112-L1123.

[31]Zheng LZ, Cao HJ, Chen SH, et al. Blockage of Src by specific siRNA as a novel therapeutic strategy to prevent destructive repair in steroid-associated osteonecrosis in rabbits[J]. J Bone Miner Res, 2015, 30(11):2044-2057.

[32]Clement-Lacroix P, Ai M, Morvan F, et al. Lrp5-independent activation of Wnt signaling by lithium chloride increases bone formation and bone mass in mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005， 102(48):17406-17411.

[33]Wolski H, Drweska-Matelska N, Seremak-Mrozikiewicz A, et al. The role of Wnt/β-catenin pathway and LRP5 protein in metabolism of bone tissue and osteoporosis etiology[J]. Ginekol Pol, 2015, 86(4):311-314.

[34]Kobayashi Y, Uehara S, Udagawa N, et al. Regulation of bone metabolism by Wnt signals[J]. J Biochem, 2016, 159(4):387-392.

[35]Liu J, Guo X, Ge Z, et al. Mutation and expression of LEF1 in adult acute lymphocytic leukemia and their clinical significance[J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 2014, 22(5):1212-1216.

[36]Castro VM, Roberson AM, McCoy TH, et al. Stratifying risk for renal insufficiency among lithium-treated patients: an electronic health record study[J]. Neuropsychopharmacology, 2016, 41(4):1138-1143.

(收稿：2015-12-18; 修回：2016-03-19)

(本文编辑：卢千语)

国家自然科学基金(81472066)

200233，上海交通大学附属第六人民医院骨科

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.03.012