远志皂苷对缺氧/复氧损伤新生大鼠神经细胞的保护作用及其机制

刘威，王爽，温娜，王洪羽，金宏

(1吉林医药学院临床医学院，吉林吉林 1320132 ；2吉林医药学院基础医学院)



远志皂苷对缺氧/复氧损伤新生大鼠神经细胞的保护作用及其机制

刘威1，王爽2，温娜2，王洪羽1，金宏1

(1吉林医药学院临床医学院，吉林吉林 1320132 ；2吉林医药学院基础医学院)

目的观察远志皂苷(Sen)对缺氧/复氧损伤(H/R)新生大鼠神经细胞的保护作用，并探讨其机制。方法对数生长期新生大鼠神经细胞分为A、B、C、D、E组，A、B、C、D组分别加入800 μmol/L的H2O2无血清DMEM培养液培养1 h，使神经细胞发生H/R。A、B、C组分别加入终浓度为50、100、200 μmol/L Sen 的DMEM培养液，D、E两组加入等量细胞培养液。分别于培养24、48、72 h时取各组细胞，采用MTT法检测各组细胞生存情况，计算细胞存活率。培养48 h时检测各组细胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2、乳酸脱氢酶(LDH)及细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。结果随Sen浓度升高，细胞生存率升高，且随培养时间增加，细胞生存率升高，P均<0.05。与D组比较，A、B、C组上清液Caspace-3，Bax表达降低，Bcl-2/Bax升高，SOD活性增加，LDH、MDA表达降低，P均<0.05。结论Sen可减轻新生大鼠神经细胞H/R损伤程度，其机制可能与其下调Caspase-3、Bax表达、提高细胞膜稳定性有关。

远志皂甙；神经细胞；缺氧/复氧损伤；Caspase-3；Bax、Bcl-2乳酸脱氢酶；超氧化物歧化酶；丙二醛

缺氧/复氧损伤(H/R)是指组织、细胞在缺血缺氧损伤后血流再通时损伤反而加重的一种情况，多种脑血管疾病的损伤机制与神经细胞的H/R关系密切[1]。远志皂苷(Sen)是传统中药远志的提取物，中医认为其具有安神益智的药理作用，利用其抗衰老、抗氧化等生物活性广泛入药治疗心脑血管疾病，但具体作用机制尚不明确[2]。Caspase-3是一种促凋亡的蛋白酶、Bax、Bcl-2是细胞凋亡过程中两个重要的调控因子。乳酸脱氢酶(LDH)为细胞线粒体内容物，其含量检测可反映细胞膜的完整性。超氧化物歧化酶(SOD)是细胞内具有抗氧化作用的酶，脂质过氧化物(MDA)是细胞膜氧化的产物，两者活力和含量可反映细胞抗氧化的能力。2015年1月起我们观察了Sen对H/R新生大鼠神经细胞的保护作用，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞及试剂新生(出生48 h内)SD大鼠神经细胞由本实验室制备。Sen标准品购于中国食品药品检定研究所。

1.2新生SD大鼠神经细胞培养、分组及Sen给予方法取对数生长期的新生大鼠神经细胞，将细胞分为A、B、C、D、E组，每组5个复孔，A、B、C、D组分别加入800 μmol/L的H2O2无血清DMEM培养液培养1 h，使神经细胞发生H/R。根据前期研究发现细胞存活率在40%～60%证明神经细胞发生H/R。造模后A、B、C组分别加入终浓度为50、100、200 μmol/L Sen 的DMEM培养液，D、E两组加入等量细胞培养液。各组均培养24 h备用。

1.3各组细胞存活情况观察采用MTT法。分别于培养24、48、72 h时对数生长期各组细胞，1×105/孔接种于96孔板，每组5个复孔，PBS清洗，每孔加入150 μL无血清培养液及5 mg/mL MTT20 μL，孵育4 h，离心后取上清，加入150 μL DMSO，振荡 10 min，待蓝紫色结晶晶体完全溶解后，采用酶标仪检测各组在490 nm 波长处的光密度(OD)值，重复3次，取平均值，计算细胞存活率。细胞存活率=(OD对照组-OD干预组)/OD对照组×100%。

1.4各组细胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2检测培养48 h时取对数生长期各组细胞，每孔取上清50 μL，PBS冲洗，4 ℃过夜后吸弃，每孔加入封闭液200 μL，37 ℃孵育1.5 h，加入Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗(1∶1 000)100 μL，4 ℃过夜。加入二抗(1∶1 000)100 μL，37 ℃孵育1.5 h，加入100 μL显色液室温避光显色孵育30 min，采用酶标仪检测各组细胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2在492 nm 波长处的吸光度(A值)，以此反应其含量。

1.5各组细胞上清液LDH及细胞SOD、MDA检测培养48 h时取各组细胞采用南京建成LDH试剂盒检测各组细胞上清液LDH活性，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。另取各组细胞，用超声波破碎仪将其破碎，按南京建成SOD试剂盒(羟胺法)说明步骤测定各样本吸光度值，计算各样本SOD 活力。同样用试剂盒(TBA法)检测并计算MDA含量。

2　结果

2.1不同时间点各组细胞存活率比较不同时间点各组细胞存活率比较见表1。

表1　不同时间点各组细胞存活率比较±s)

注：与D组比较，*P<0.05；与A组比较，△P<0.05；与 B组比较，#P<0.05。

2.2各组细胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bcl-2/Bax比较结果见表2。

表2　各组细胞上清液Caspase-3、Bax、Bcl-2及Bcl-2/ Bax比较

注：与D组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与 B组比较，#P<0.05。

2.3各组细胞上清液LDH及细胞SOD、MDA比较结果见表3。

表3　各组细胞上清液LDH及细胞SOD、MDA活性比较

注：与D组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05；与 B组比较，#P<0.05。

3　讨论

H/R损伤的分子机制较为复杂，目前研究表明该损伤与再灌注过程与氧自由基爆发[3,4]及凋亡蛋白表达有关[5,6]。研究认为H/R损伤的具体过程及机制如下：①细胞氧化损伤主要是由反应ROS引起的，它介导的氧化应激损伤与各种心脑病的发生和发展有关[9]。如线粒体膜破坏时，LDH外漏，因此可通过检测细胞外液中LDH活性判断细胞受损情况。SOD活性高低直接反应机体清除氧自由基的能力[7]。②H/R损伤可引起细胞凋亡，该过程与凋亡蛋白及相关调控因子有关。Caspase-3是一种具有凋亡效应的蛋白酶，发挥降解细胞蛋白作用，导致细胞凋亡[8]。Bcl-2与Bax是两类重要的调控因子，在缺氧等损伤因素作用下Bax表达明显增高，启动细胞凋亡程序；在抗缺氧药物的作用下Bcl-2表达明显，起到保护细胞的作用，抑制细胞凋亡[9]。

远志是我国传统医学中常用的一种中草药，其富含皂苷类、寡聚糖类、山酮类化合物，在益智、抗退化，催眠等方面有独特疗效[10，11]。研究[12,13]表明远志皂甙可通过提高微管相关蛋白水平及促进内源性神经营养因子的释放，以促进神经元细胞的存活与生长，具有神经营养作用，且通过多种途径对不同种类的原代细胞氧化应激损伤具有保护作用[14,15]。在前人研究基础上本实验重点研究对神经元缺氧复氧损伤的保护机制。首先利用H2O2建立细胞缺氧模型，H2O2是ROS的一种，其可迅速透过细胞膜，引发细胞内物质过氧化反应，影响细胞功能，造成细胞氧化损伤，常用于制备缺氧液。本实验前期研究发现，H2O2作用于原代乳鼠神经细胞1 h造成的缺氧损伤可最大程度的模拟细胞体内缺氧损伤，因此本实验选择该浓度制备细胞缺氧模型。实验结果显示，与E组相比，D组细胞OD值明显下降，计算细胞存活率在40%～60%之间，说明造模成功。MTT实验结果显示，与D组相比A、B、C三组的OD值在24、48、72 h均升高，说明不同浓度Sen作用不同时间后可提高细胞存活率，使细胞处于功能活跃状态，其中作用48 h效果较好。由此可见Sen对H/R损伤神经细胞具有保护作用，推测其可能机制为:①Sen可通过提高膜稳定性对抗细胞受到的H/R损伤。实验结果中对各组细胞SOD活性、LDH、MDA含量测定表明,与D组相比A、B、C各组细胞LDH外漏减少，说明用Sen后线粒体膜稳定性增加；SOD活性增加，MDA生成减少，说明细胞抗氧化能力增强，由此可见Sen可减少氧化损伤对神经细胞膜的破坏,支持该推测。②Sen可减少H/R损伤导致的细胞凋亡。Sen可调节Caspase家族基因表达，减少其级联反应引起的细胞蛋白降解，从而保护细胞；另外各药物组Bax下降，说明启动细胞凋亡的调控因子Bax受到抑制；Bcl-2/Bax比值上调，进一步表明抑制细胞凋亡的调控因子Bcl-2占优势，从而减少H/R损伤引起的神经细胞凋亡。

综上所述，Sen可减轻新生大鼠神经细胞H/R损伤程度，其机制可能与其下调Caspase-3、Bax表达、提高细胞膜稳定性有关。但其对H/R损伤神经细胞保护作用的其他机制还有待进一步研究。

[1] 陈伟荣，燕毅男,崔红丽,等.远志总皂苷对阿尔茨海默病模型大鼠海马脑源性神经营养因子及酪氨酸蛋白激酶B表达的影响[J].中国现代神经疾病杂志,2014,14(5):421-426.

[2] 皮婷,薛小燕,林炼峰,等.远志皂苷元对新生大鼠皮质神经元的营养作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2011,25(1):40-44.

[3] 冯金洲.雌激素抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠NF-kB和Rho的表达[J].中国精神神经疾病杂志，2013，39(8):479-484．

[4] 江文青,李加梅,王韫智,等.异菝葜皂苷元对H2O2氧化损伤SH-SY5Y细胞的保护作用及其分子机制[J].上海交通大学学报(医学版),2015 ,35(5)：631-636.

[5] 邓丽娟，骆淑媛.OBHS对C6神经胶质瘤细胞H2O2损伤的保护作用[J].绿色科技，2015，11(7):256-257.

[6] 余薇,查文良,吴基良,等.葛花总黄酮对缺氧/复氧心肌细胞的抗氧化作用研究[J].时珍国医国药,2013,24(3):588-590.

[7] 刘甦,岳红,杨晓瑞,等.氧化应激在七氟醚保护大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用[J].山东医药,2011,51(21):26-27.

[8] 叶海燕,陈勤.远志皂甙对AB1-40诱导的AD大鼠学习记忆功能障碍的保护作用研究[J].中国新药杂志,2013,22(22)：2674-2678.

[9] 董雅洁,高维娟.bcl-2，bax，caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系[J].中国老年学杂志,2012,32,(11):4828-4830.

[10] 马洪伟,付文亮,钟美蓉,等.远志药理活性研究进展[J].承德医学院学,2010,27(2):196-198.

[11] 刘大伟,康利平,马百平,等.远志化学及药理作用研究进展 [J]国际药学研究杂,2012，39(1):32-36.

[12] 皮婷，薛小燕，罗焕敏，等.远志皂苷元神经营养作用研究[J].中药材，2013，36(9)：1477-1480.

[13] 赵严冬,刘潘虹,李学敏,等.远志皂苷元抗诱导皮层神经元凋亡的机制初探[J].中国病理生理杂志,2014,30(7):1166-1171.

[14] 陈玉静,黄小波,陈文强,等.远志皂苷元对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(11):1028-1030.

[15] 陈刚领,郑建普,李亚娟.H2O2氧化损伤血管内皮模型的构建及超氧化物歧化酶对损伤的逆转作用[J].中国药理学通报,2009，25(7):884-887.

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究规划项目(吉科教合字[2015]第408号)。

金宏(E-mail: jinhong0706@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.27.011

R966

A

1002-266X(2016)27-0036-03

2016-03-28)