聚乙二醇偶联羟基喜树碱的合成、表征及聚集行为

邱传龙, 李春芳, 李东祥, 侯万国

(1. 青岛科技大学化学与分子工程学院, 生态化工国家重点实验室培育基地, 青岛 266042;2. 山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室, 济南 250100)



聚乙二醇偶联羟基喜树碱的合成、表征及聚集行为

邱传龙1, 李春芳1, 李东祥1, 侯万国2

(1. 青岛科技大学化学与分子工程学院, 生态化工国家重点实验室培育基地, 青岛 266042;2. 山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室, 济南 250100)

通过羟基喜树碱(HCPT)的10位羟基与聚乙二醇单甲醚(MPEG)之间的成醚反应, 制备了MPEG化学偶联的HCPT(MPEG-HCPT); 采用1HNMR和FTIR等进行了结构表征. 考察了MPEG偶联后对HCPT药物的水溶性和内酯环稳定性的影响, 研究了MPEG-HCPT在水溶液中的聚集行为. 结果表明,MPEG-HCPT中HCPT原药的质量分数约为33%, 在37 ℃,pH=4.8和7.2的缓冲溶液中的溶解度分别为5.23和7.90mmol/L, 明显高于HCPT原药(0.0026和0.035mmol/L). 该偶联药物在37 ℃下的pKah=7.12(Kah为表观水解反应平衡常数), 高于HCPT原药(6.67), 说明MPEG的偶联对HCPT内酯环结构具有一定的稳定作用. 研究还发现, 该偶联药物具有明显的表面活性, 在水溶液中可形成疏水药物为内核、亲水聚乙二醇为外壳的聚集体, 其临界聚集浓度约为0.46mmol/L.

羟基喜树碱; 聚乙二醇; 溶解度; 内酯环稳定性

羟基喜树碱(HCPT)是一种吲哚生物碱类抗肿瘤药物, 能抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ繁殖从而阻止肿瘤细胞的生长, 对胃癌、肝癌和胰腺癌等均有良好疗效[1～3]. 但其存在2个缺点限制了临床应用[2～7]: 一是其在体液中溶解度极低, 难以达到有效治疗浓度; 二是其具有生物活性的内酯环(E环)结构(Lactoneform)不稳定, 在碱性(pH> 8)条件下可发生水解反应[8]而转变为非生物活性且具有毒副作用的羧酸盐结构(Carboxylateform, 图1). 为提高HCPT的溶解度并稳定其内酯环结构, 已开展了包括HCPT分子修饰[9～13]和新剂型研制[4,5,14～21]等工作. 用水溶性聚合物对HCPT进行化学键合修饰, 可提高药物的水溶性和生物利用度, 降低免疫原性和抗原活性, 延长循环时间和半衰期及赋予药物被动靶向能力等, 进而提高药效[9,10]. 已研究的水溶性聚合物修饰剂包括聚乙二醇(PEG)、环糊精和聚谷氨酸等.PEG是美国食品药品管理局(FDA)批准的几种可药用合成聚合物之一, 具有良好的生物相容性[9～13,22～24]. 本文选取聚乙二醇单甲醚(MPEG)为修饰剂, 通过与HCPT的10位羟基成醚反应, 制备了MPEG偶联HCPT(MPEG-HCPT); 考察了MPEG的偶联对HCPT药物的水溶性和内酯环稳定性的影响; 还对其在水溶液中的表面活性进行了初步研究.

Fig.1　Hydrolysis reaction of HCPT

1　实验部分

1.1试剂与仪器

羟基喜树碱(HCPT, 纯度≥99%, 湖北浩博化工药物有限公司); 聚乙二醇单甲醚(分子量750, 纯度≥99%,Sigma-Aldrich公司); 其它试剂均为分析纯.

德国Bruker公司AV-500型核磁共振仪; 美国Nicolet公司IS10型傅里叶变换红外光谱仪; 北京普析通用公司TH-1901型紫外-可见分光光度计; 日本Hitachi公司F-2700型荧光光谱仪; 上海中晨公司JK99C型全自动表面张力仪; 英国Malvern公司NanoZS90型粒度分布分析仪.

1.2实验过程

1.2.1MPEG-HCPT的合成如图2所示,MPEG-HCPT的合成分3步进行. 首先制备末端氯代MPEG(MPEG-Cl)[25], 再通过卤素互换制备末端碘代MPEG(MPEG-Ⅰ)[26], 最后MPEG-Ⅰ与HCPT的10位羟基反应生成醚, 得到目标产物MPEG-HCPT.

MPEG-Cl的合成: 向100mL三口烧瓶中加入11.4gMPEG, 在氮气保护下加入90mL二氯亚砜(SOCl2), 于75 ℃搅拌回流反应24h; 旋蒸除去过量的SOCl2, 将所得产物溶于40mLCH2Cl2中, 用饱和食盐水洗涤2次除去SOCl2水解产生的酸; 经无水Na2SO4干燥后, 减压旋蒸除去溶剂, 得淡黄色MPEG-Cl, 产率约为68.5%.

MPEG-I的合成: 将4.3gMPEG-Cl置于50mL三口烧瓶中, 加入30mL无水丙酮, 搅拌溶解, 加入1.19gKI, 于55 ℃搅拌回流反应3h后, 再加入0.086gKI, 继续反应8h; 过滤除去沉淀物, 旋蒸除去溶剂; 将剩余物溶于20mLCH2Cl2中, 用饱和食盐水洗涤2次, 经无水Na2SO4干燥后旋蒸除去溶剂, 得黄色产物MPEG-I, 产率约为78.0%.

MPEG-HCPT的合成: 向250mL三口瓶中加入3.51gMPEG-Ⅰ, 1.45gHCPT, 0.274g碳酸钾和150mLN,N-二甲基甲酰胺, 搅拌溶解后于75 ℃回流反应24h; 减压蒸除DMF, 得深棕色胶状混合物. 将混合物溶于30mL甲醇中, 超声分散处理10min, 经离心除去不溶无机盐, 上层清液经旋蒸除去溶剂, 得到固体混合物. 将该固体混合物超声分散于乙酸乙酯中, 溶解未反应的MPEG, 离心收集底部沉淀得到固体粗产物. 将固体粗产物用2mL乙酸乙酯/甲醇(体积比3∶1)混合溶剂溶解, 采用干法装柱以甲醇作洗脱剂进行柱色谱分离, 得棕色粉末状目标产物MPEG-HCPT, 产率为33.8%.

1.2.2MPEG-HCPT溶解度的测定取一定量的MPEG-HCPT分别溶于pH为4.8和7.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中, 逐渐稀释得到不同浓度(c)的溶液, 测定其在波长λ=375nm处的吸光度(A), 绘制A-c标准工作曲线. 取足量的MPEG-HCPT加入定量缓冲溶液中, 在37 ℃下搅拌24h达到溶解平衡, 在10000r/min转速下离心30min, 取上层清液测定其在波长λ=375nm处的吸光度(A), 依据A-c标准工作曲线计算溶解度.

1.2.3UV-Vis光谱的测定为研究不同条件下内酯环的稳定性, 分别在不同药物浓度(cD)和不同pH值下测定了HCPT原药和MPEG-HCPT的UV-Vis光谱, 分别用于制作标准曲线和考察pH值对内酯环结构稳定性的影响. 由于HCPT在低pH水中溶解度太低无法得到UV-Vis光谱, 故使用水-DMSO(体积比3∶1)混合溶剂.

HCPT原药溶液的配制. 取11mgHCPT溶于DMSO中, 置于25mL容量瓶中定容, 得HCPT/DMSO母溶液(浓度0.44mg/mL). (1)用pH=4.0的盐酸溶液与DMSO按体积比3:1混合, 配制酸性水-DMSO混合溶剂; 取适量HCPT/DMSO母溶液, 用酸性水-DMSO混合溶剂稀释, 得到系列浓度(4.40～11.0μg/L)pH=4.0的内酯型HCPT溶液. (2)用pH=10.0的NaOH溶液与DMSO按体积比3∶1混合, 配制碱性水-DMSO混合溶剂; 取适量HCPT/DMSO母溶液, 用碱性水-DMSO混合溶剂稀释, 得到系列浓度(4.40～11.0μg/L)pH=10.0的羧酸盐型HCPT溶液. (3)配制pH值=4～10的系列磷酸盐缓冲溶液, 溶剂中水和DMSO的体积比为3∶1; 取80μLHCPT/DMSO母溶液, 分别加入到6mL该系列缓冲溶液中, 得到浓度为5.54μg/L而具有不同pH值(4～10)的HCPT溶液.

MPEG-HCPT样品溶液的配制. 配制方法同HCPT原药溶液, 在配制MPEG-HCPT/DMSO母溶液时按样品中HCPT原药的含量计算MPEG-HCPT用量, 以保持各溶液原药浓度一致.

1.2.4表面活性的测定称取一定量MPEG-HCPT和HCPT样品, 溶于不同pH值(4.8, 7.2或11.0)的缓冲溶液中, 充分混合, 配制成具有不同浓度(c)和不同pH值的水溶液, 室温下静置1h后, 采用表面张力仪和动态光散射仪分别测定其表面张力(γ)和聚集体的平均水化半径(Rh).

其实最关键的是，硝酸磷肥在解决磷营养的同时不会产生磷石膏。杨福旺告诉记者：“天脊硝酸磷肥的副产品是轻质碳酸钙，它是土壤调理最好的东西，它容易分解，在它分解的过程中释放二氧化碳，提高土壤的pH值，同时释放钙离子、镁离子，同时还有3-4个氮磷养分。”也就是说，天脊硝酸磷肥的副产品是非常好的钙肥，不会对环境产生污染，这等于把资源吃干榨净。

取50μLHCPT的甲醇/水(体积比为2∶1)饱和溶液, 加入到8mL设定pH值的缓冲溶液中, 静置24h得到HCPT溶液. 取100μL预先配制的MPEG-HCPT水溶液(c=1mg/mL), 加入到8mL设定pH值的缓冲溶液中, 静置24h得到MPEG-HCPT溶液. 在发射波长λem=375～700nm范围内测定HCPT和MPEG-HCPT溶液的荧光发射光谱, 激发波长λex=365nm.

将2mL3.96 × 10-6mol/L芘水溶液加入2mL设定浓度和pH值的HCPT或MPEG-HCPT溶液中, 超声5min, 静置30min, 在λem=370～400nm范围内测定芘的稳态荧光发射光谱(λex=330nm).

1.2.5电势滴定实验取20mgMPEG-HCPT溶于20mL超纯水中, 再加入20mLHCl溶液(pH=3.7), 摇匀, 调节溶液pH值至3.98; 将浓度为6.0mmol/L的NaOH溶液缓慢滴加入MPEG-HCPT溶液中, 记录NaOH溶液用量与滴定体系的pH值; 以不含MPEG-HCPT的空白溶液为参比, 得出不同pH值时HCPT内酯环水解所消耗的NaOH的量, 从而计算出内酯环型和羧酸盐型HCPT的相对含量.

2　结果与讨论

2.1MPEG-HCPT的合成

HCPT分子中10位羟基为偶联MPEG提供了结合点, 但MPEG端羟基活性低, 难以与HCPT的10位羟基直接成醚偶联. 如图2所示, 首先制备末端氯代MPEG(MPEG-Cl)[25]; 再采用卤素互换法制备末端碘代MPEG(MPEG-I)[26]; 最后用端基活性高的MPEG-I与HCPT的10位羟基进行成醚反应, 制备了MPEG-HCPT. 实验中发现, 所合成的MPEG-HCPT和MPEG在乙酸乙酯中的溶解性差异很大, 前者仅为微溶, 后者溶解性很好, 这是由于HCPT结构不溶于乙酸乙酯而降低了整个化合物的溶解性. 因此, 采用乙酸乙酯浸取未反应的MPEG, 获得良好的分离效果, 使随后的柱分离纯化更为高效.

2.2MPEG-HCPT的表征

Fig.3　1H NMR(A) and FTIR(B) spectra of HCPT(a), MPEG-HCPT(b) and MPEG(c)

Fig.4　UV-Vis spectra of HCPT(A) and MPEG-HCPT(B) in buffer solutions with various pH values and variation of relative percentages of lactone form and carboxylate form vs. pH for HCPT(C) and MPEG-HCPT(D) pH: (A) a—k. 3.5, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9.5; (B) a—j. 4, 5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11.

2.3MPEG-HCPT的溶解度

研究发现, 在pH=4.8和7.2的缓冲溶液中,MPEG-HCPT浓度在10～40mg/L范围内, 其吸光度与浓度呈良好的线性关系, 线性相关系数R2≥0.999, 可用作标准工作曲线. 根据饱和溶液吸光度测定结果及标准工作曲线, 得出37 ℃下在pH=4.8(模拟细胞核pH)和7.2(模拟体液pH)的缓冲溶液中,MPEG-HCPT的溶解度分别为5.73和8.66g/L, 可分别对应5.23和7.90mmol/L, 而HCPT原药的溶解度分别仅为0.0026和0.035mmol/L. 因此,MPEG-HCPT在不同pH值缓冲溶液中的摩尔溶解度分别为HCPT原药的2011倍和225倍. 可见, 亲水性MPEG的偶联使HCPT在水中的溶解度大大提高, 这对其临床应用具有重要意义.

2.4MPEG-HCPT内酯环结构的稳定性

采用UV-Vis吸收光谱法对比研究了pH值对MPEG-HCPT和HCPT内酯环稳定性的影响. 图4 为HCPT和MPEG-HCPT在不同pH缓冲溶液中的UV-Vis光谱图. 由图4(A)可见,HCPT的最大吸收波长(λmax)在pH<5时为384nm, 而当pH>7.5时为414nm; 随着pH值增大, 384nm处的吸收强度逐渐减弱, 而414nm处的吸收强度逐渐增强, 这是由于HCPT由内酯环结构逐渐水解转化为羧酸盐结构所致[29]. 与HCPT相比,MPEG-HCPT的UV-Vis吸收光谱发生了明显变化[图4(B)], 其λmax约为348nm; 随着pH值增大, 348nm处的吸收峰强度降低, 而约425nm处的吸收峰强度增大.MPEG本身在300～600nm范围内无吸收,MPEG与HCPT物理混合也不影响HCPT的UV-Vis光谱. 因此,MPEG-HCPT与HCPT的UV-Vis吸收光谱的明显差异表明,MPEG与HCPT的化学键合影响了HCPT结构单元的吸收特性.

文献[30,31]报道的双波长分光光度计法(简称TWS法)可以推算HCPT和MPEG-HCPT的pKah值.HCPT的2个波长选取为350和384nm,MPEG-HCPT的2个波长选取为316和400nm. 实验分别在pH=4.0(对应内酯环结构)和11.0(对应羧酸盐结构)的缓冲溶液中测定了HCPT和MPEG-HCPT在不同浓度(c)下的UV-Vis光谱, 作为TWS法测定pKah值的标准曲线. 由HCPT的标准曲线拟合得到HCPT内酯环型的浓度[cL-HC/(mg·L-1)]和羧酸盐型的浓度[cH-HC/(mg·L-1)]与350nm处的吸光度(A350)和384nm处吸光度(A384)之间的关系式为

(1)

(2)

同样, 由MPEG-HCPT的标准曲线拟合得到MPEG-HCPT内酯环型和MPEG-HCPT羧酸盐型的浓度[cL-MHC/(mg·L-1)和cH-MHC/(mg·L-1)]与316和400nm处吸光度(A316和A400)的关系式为

(3)

(4)

根据图4(A)和(B)中的吸光度值, 由式(1)～(4)计算出HCPT和MPEG-HCPT在不同pH值下内酯环型和羧酸盐型的相对浓度, 结果如图4(C)和(D)所示. 可见, 当pH<5时,HCPT和MPEG-HCPT主要以内酯环形式存在, 当pH>9时,HCPT和MPEG-HCPT主要以羧酸盐形式存在, 而当pH=7～9时, 内酯环结构逐渐水解转化为羧酸盐结构[7]. 当内酯环型和羧酸盐型组分的相对摩尔分数均为50%(或内酯环开环率为50%)时, 对应的pH值即为药物的pKah值. 由图4(C)和(D)结果可知,HCPT和MPEG-HCPT的pKah值分别为6.67和7.24. 另外, 采用电势滴定法测定了MPEG-HCPT内酯环型和羧酸盐型相对含量随pH值的变化, 得到pKah值为6.99, 与TWS法结果基本一致. 结合TWS法和电势滴定法结果, 可得出MPEG-HCPT的平均pKah值为7.12. 因此, 从pKah值结果看,MPEG的偶联对HCPT内酯环结构具有一定的稳定作用.

2.5MPEG-HCPT在水溶液中的表面活性

由于MPEG-HCPT分子中一端为亲水PEG基团, 另一端为疏水HCPT药物结构, 为双亲分子结构, 其在水溶液中的组装聚集对药物的应用具有重要意义. 因此, 采用表面张力、芘稳态荧光发射光谱和动态光散射方法, 研究了MPEG-HCPT在水溶液中的聚集行为, 并与HCPT进行了对比. 图5(A)为MPEG-HCPT水溶液在不同pH值时的表面张力γ曲线, 可见,MPEG-HCPT具有明显的表面活性, 随其浓度增大, γ先明显下降, 后趋于平缓或平衡. 另外, 随着pH值增大,MPEG-HCPT的表面活性降低, 这是由于HCPT内酯环水解使其双亲性减弱所致; 当pH=11时,MPEG-HCPT仍具有表面活性, 表明羧酸盐型的HCPT仍具有疏水性. 由图5(A)结果可知,MPEG-HCPT的临界胶束浓度约为0.5g/L(即0.46mmol/L). 作为对比, 测定了HCPT溶液的表面张力随浓度的变化, 结果表明, γ值基本不变, 证明其无明显表面活性.

Fig.5　　　　Variation of surface tension(A), I5/I1 value(B), and dynamic radius(Rh)(C) of 　　　MPEG-HCPT aggregates vs. concentration with different pH values

芘是研究双亲分子聚集行为和微环境极性的常用荧光探针, 芘分子在370～400nm范围内有5个荧光发射峰, 其第5峰(约为392nm)荧光强度(I5)与第1峰(约为372nm)荧光强度(I1)的比值(I5/I1)与微环境极性有关, 其随着环境极性减弱而增大[32]. 图5(B)为MPEG-HCPT溶液的I5/I1值随MPEG-HCPT的浓度c和pH值的变化. 可以看出, 在pH=4.8和7.2溶液中, 芘的I5/I1值随着c增大而逐渐增大, 表明由于MPEG-HCPT的聚集产生了疏水性微区. 随着MPEG-HCPT浓度的增大, 逐步有聚集体形成. 然而, 在pH=11时,MPEG-HCPT结果与HCPT基本一致, 均不存在疏水区. 这是因为碱性条件下HCPT羧酸盐结构周围吸附了大量水分子,MPEG-HCPT分子聚集形成HCPT内核的疏水性不强, 极性与水接近.

图5(C)为动态光散射法测定的MPEG-HCPT溶液在不同pH值时, 聚集体的动态力学半径(水化半径)Rh值随浓度的变化曲线. 可见, 在很低的MPEG-HCPT浓度(30mg/L)时, 溶液中即存在水化半径为130～150nm的聚集体, 表明MPEG-HCPT在溶液中很容易发生预胶束过程; 当溶液浓度达到0.5g/L时, 溶液中聚集体的尺寸基本稳定, 不同pH值下的水化半径均在210～250nm之间, 对应的临界胶束浓度也是0.50g/L(0.46mmol/L), 这与表面张力研究结果一致. 在测定HCPT溶液的Rh值时, 发现HCPT溶液无粒度响应, 不存在组装结构. 这些结果与表面张力、芘荧光光谱结果一致, 证明MPEG-HCPT分子在水溶液中容易形成以疏水HCPT为内核、亲水MPEG为外壳的聚集体. 由于PEG分子的生物兼容性, 这种MPEG-HCPT组装聚集形成的结构具备在生物体内的伪装隐形能力.

3　结　　论

通过HCPT的10位羟基成醚反应, 制备了MPEG偶联HCPT, 其中HCPT药物的质量分数约为33%, 在37 ℃,pH=4.8和7.2的缓冲溶液中的溶解度分别为5.23和7.90mmol/L, 分别为HCPT原药溶解度的2011和225倍. 研究表明,MPEG-HCPT在37 ℃下pKah≈7.12, 高于HCPT原药的pKah值(约为6.67), 表明MPEG偶联对HCPT内酯环结构有一定的稳定作用. 此外,MPEG-HCPT具有明显的表面活性, 在水溶液中可形成聚集体, 其临界聚集浓度约为0.46mmol/L. 本文研究结果对HCPT剂型研制和临床应用具有重要的参考价值.

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(Ed.:V,Z,K)

Synthesis,CharacterizationandAggregationBehaviorofPolyethyleneGlycol-conjugatedHydroxycamptothecin†

QIUChuanlong1,LIChunfang1,LIDongxiang1,HOUWanguo2*

(1. College of Chemistry and Molecular Engineering, State Key Laboratory Base of Eco-chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China;2. Key Laboratory of Colloid and Interface Chemistry(Ministry of Education), Shandong University, Jinan 250100, China)

Methoxypolyethyleneglycol(MPEG)-conjugatedhydroxycamptothecin(HCPT),denotedasMPEG-HCPT,wassynthesizedviaetherificationreactionbetweenterminalhydroxylofMPEGand10-hydroxyofHCPT,andtheywerecharacterizedvia1HNMRandFTIR.TheeffectofMPEGconjugationonthesolubilityandlactone-ringstabilityofHCPTwasinvestigated,aswellasitsaggregationbehavior.ThemassfractionofHCPTinthederivativewasapproximately33%andthesolubilityoftheMPEG-HCPTinbuffersolutionsofpH4.8and7.2at37 ℃wererespectively5.23and7.90mmol/L,significantlyhigherthanthoseofpristineHCPT(0.0026and0.035mmol/L).ThepKah(Kah,theapparenthydrolysisequilibriumconstant)ofMPEG-HCPTat37 ℃wasdeterminedtobeapproximately7.12,higherthanthatofpristineHCPT(ca. 6.67),indicatingthattheMPEGconjugationcouldenhancethelactone-ringstabilityofHCPT.TheMPEG-HCPTexhibitedobvioussurfaceactivity,andcouldformaggregatesinwaterwithaaggregationmicelleconcentrationof0.46mmol/L.

†SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(Nos.21273123, 21573133).

Hydroxycamptothecin;Polyethyleneglycol;Solubility;Lactoneringstability

2015-11-23. 网络出版日期: 2016-07-14.

国家自然科学基金(批准号: 21273123, 21573133)资助.

O648;O629.3

A

联系人简介: 侯万国, 男, 博士, 教授, 主要从事胶体与表面化学研究.E-mail:wghou@sdu.edu.cn