异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶性质

徐 　 丹，　金 凤 燮，　鱼 红 闪

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶性质

徐 丹，金 凤 燮，鱼 红 闪

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

采用分子筛及离子交换法对微生物Absidiasp.R42g所产异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶进行分离纯化，并研究其酶学性质。结果表明,异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分子质量为62 ku，最适温度为40 ℃，最适pH为5.0。在50 ℃以下，pH 4.0～6.0，相对酶活力较稳定，Na+、K+、Ca2+3种金属离子对相对酶活力无影响；而在Fe3+、Cu2+两种金属离子存在的情况下，相对酶活力为零；酶反应结果显示该酶的最大反应速度和米氏常数分别为6.711 mmol/(L·h) 和18.89 mmol/L。

异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶；分离纯化；酶性质

0　引　言

异槲皮苷(Isoquercitrin)为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、降压等生物活性[1]。异槲皮苷的3-C位水解掉葡萄糖基，成为槲皮素(quercetin)，该类化合物及其衍生物同属于类黄酮化合物，在果蔬及中草药中大量存在。槲皮素具有广泛的生物活性，不仅对癌症有化学预防作用，还具有抗癌和抗突变等多种生理功能。近期研究还发现它是强有力的肿瘤多药耐药的逆转剂。人体对槲皮素的不良反应表现不明显，所以具有良好的开发前景和药用价值[2]。本实验研究了利用酶水解法由异槲皮苷制备槲皮素所需的酶，并对其酶学性质进行了探讨。

1　材料与方法

1.1材料

液体培养基：12%的槐花浸出液中加入48%的麦芽汁，糖度为5°；菌种：Absidiasp.R42g，实验室保藏。

1.2方法

1.2.1酶蛋白的分离纯化

1.2.1.1粗酶液的分离

将菌种接种于经过高温灭菌的液体培养基中，在最佳发酵条件下发酵3～5 d。

将发酵液离心，取上清，加入硫酸铵至饱和度75%，4 ℃静止过夜。离心去除上清，收集沉淀。用pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并在该缓冲体系中透析2 d，离心收集上清即为所需粗酶液。

1.2.1.2层析分离

葡聚糖凝胶层析法对酶进行初步分离，用缓冲液作洗脱剂，洗脱液体积流量0.5 mL/min，每10 min收集一管。采用TLC法进行酶活检测，确定酶活较高的收集管，合并酶液进行离子交换层析。离子交换层析法对酶进行再次分离，将8 mL 收集的酶液上柱后，先用缓冲液洗脱，再分别以0.02 mol/L pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液配制的60、120、150、180、210、240、300 mmol/L KCl溶液为流动相进行梯度洗脱，流动相体积流量为1 mL/min，分离提纯蛋白质。洗脱液在280 nm下测定OD，并通过蛋白质色谱仪绘出吸收图谱。

1.2.2酶活力的测定

薄层层析法测定酶活力，展开剂为体积比10∶7∶1∶1的乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水混合液，标准品为用0.02 mol/L pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液配制的2.0 mg/mL异槲皮苷溶液。取0.1 mL标准品底物溶液，加入等体积的酶液，在40 ℃下恒温反应14 h，加入反应液等体积的水饱和正丁醇终止酶反应，取上层液作TLC检测，计算酶活力。

1.2.3酶的纯度及分子质量测定

采用SDS-PAGE测定酶蛋白的分子质量，根据异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的相对迁移率计算分子质量。

1.2.4蛋白含量测定

用Folin-酚法测定溶液中蛋白质含量。

1.2.5酶学性质的测定

采用“1.2.2”中酶活力的测定方法测定提纯酶的最适pH、最适温度、pH稳定性、温度稳定性、金属离子对酶活力的影响[5-7]。

2　结果与讨论

2.1酶的分离纯化

各纯化步骤的结果如表1所示。由表1可知，粗酶液经过分离纯化后比活达到2.8 U/mg，提纯倍数达到12.17，收率为1.15%。分离纯化所得异槲皮苷葡萄糖苷酶经SDS-PAGE鉴定，提纯酶电泳结果为单带，结果如图1所示。

根据图1中的标准蛋白的相对迁移率与分子量的对数关系绘制标准曲线,得到回归方程：y=2.073-1.023x，R2=0.993。将异槲皮苷葡萄糖苷酶的相对迁移率带入方程，得出其分子质量约为62 ku。

表1　异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶分离纯化的结果

图1异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

Fig.1Isoquercitrin-β-glycosidase in SDS-PAGE

2.2酶学性质

2.2.1温度对相对酶活力的影响

将提纯后的酶在20～70 ℃下进行反应，检测最适反应温度,将酶在各温度条件下静置1 h，在最适温度下的进行酶反应检测其温度稳定性。根据TLC结果得出该温度下的相对酶活力，结果见图2。

图2　温度对相对酶活力的影响

由图2可知，最适酶反应温度为40 ℃。温度在45 ℃以上时，随着温度的升高，相对酶活力呈下降趋势，在50 ℃以下时，相对酶活力变化较为缓慢，都大于60%。而当温度高于60 ℃时，相对酶活力急剧下降。

2.2.2pH对相对酶活力的影响

将提纯后的酶在pH 2.0～10.0的缓冲体系内进行反应，将酶在各缓冲体系中静置1 h后，在最适pH条件下检测其稳定性。并计算不同pH条件下的相对酶活力，结果见图3。

图3　pH对相对酶活力的影响

由图3可看出，该酶在pH 为5.0 时相对酶活力最大；pH在4.0～6.0，相对酶活力变化很小，其相对酶活力可以保持大于80%，超出该范围酶活性急剧下降，因此确定该酶在pH 4.0～6.0 较稳定。

2.2.3金属离子对相对酶活力的影响

由表2可知，Na+、K+、Mg2+、Ca2+的存在不影响酶活力大小，反应液中的Zn2+对异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的相对酶活力的抑制作用随着其浓度的增加而增大，而在Cu2+、Fe3+存在的情况下异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶没有相对酶活力，因此Cu2+和 Fe3+可以完全抑制该酶的相对酶活力。

表2　金属离子对相对酶活力的影响

2.2.4酶反应动力学

配制底物质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的异槲皮苷溶液。在pH 5.0、40 ℃条件下进行酶促反应，反应时间3 h，结果见表3。

采用Lineweaver-Burk作图，由图得到米氏方程为1/[V]=2.814/[S]+0.149，R2=0.998 9，从而计算得到最大反应速度和米氏常数分别为6.711 mmol/(L·h) 及18.89 mmol/L。

表3底物浓度对酶反应速度的影响

Tab.3Theeffectsofsubstrateconcentrationonenzymereactionspeed

动力学参数c/(mmol·L-1)2.1534.3076.4608.61410.767[S]-1/(L·mmol-1)0.4640.2320.1550.1160.093[V]-1/(L·h·mmol-1)1.4660.7730.5730.4840.429

3　结　论

从Absidiasp. R42g中提取的异槲皮苷葡萄糖苷酶，分子质量大约为62 ku，最适反应温度为40 ℃，pH 5.0，具有较好的 pH耐受性和热稳定性，金属离子 Na+、K+、Mg2+、Ca2+存在时对相对酶活力无影响，Zn2+对该酶的相对酶活力的抑制作用随浓度的增大而增强，Cu2+、Fe3+存在时可以完全抑制该酶的酶活力。由动力学方程可得Vmax=6.711 mmol/(L·h)，Km=18.89 mmol/L。

[1] 周浓,杨勤,杨敏.HPLC法同时测定川楝子中芦丁、异槲皮苷和槲皮素的含量[J].药物分析杂志,2013,33(2):225-226.

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Purification and characterization of isoquercitrin-β-glucosidase

XUDan,JINFengxie,YUHongshan

(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Isoquercitrin-β-glucosidasewaspurifiedfromAbsidiasp.R42gusingmolecularsieveandtheionexchangeseparationandpurification,anditsenzymaticpropertieswerestudied.Resultsshowedthatitsmolecularmasswasabout62ku,theoptimumtemperaturewas40 ℃,theoptimumpHwas5.0.Enzymewasstablebelow50 ℃atpH4.0-6.0.TheionsofNa+,K+,Ca2+showednoinfluenceonisoquercitrin-β-glucosidaseactivitybutionsFe3+andCu2+inhibitedisoquercitrin-β-glucosidase.Theenzymekineticsofisoquercitrin-β-glucosidasewereVmax=6.711mmol/(L·h)andKm=18.89mmol/L.

isoquercitrin-β-glucosidase; purification; enzymatic characterization

徐丹,金凤燮,鱼红闪.异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶性质[J]. 大连工业大学学报,2016,35(4):243-245.

XU Dan, JIN Fengxie, YU Hongshan. Purification and characterization of isoquercitrin-β-glucosidase[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(4): 243-245.

2015-03-01.

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003).

徐 丹(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-)，男，教授.

TS201.3

A

1674-1404(2016)04-0243-03