丹皮酚对佐剂性关节炎模型大鼠关节炎5-羟色氨酸及白介素族的影响

石磊，王建杰，周成福,Δ

(1.佳木斯大学附属第一医院 骨一科，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学 基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

丹皮酚对佐剂性关节炎模型大鼠关节炎5-羟色氨酸及白介素族的影响

石磊1，王建杰2，周成福1,2Δ

(1.佳木斯大学附属第一医院 骨一科，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学 基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的探讨佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型应用丹皮酚对关节炎5-羟色氨酸及白介素族的影响。方法选取SD大鼠100只，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组、雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组，各20只。各组均采用弗氏完全免疫佐剂左后足趾皮内注射建立AA大鼠模型，并给予相应的药物治疗。观察所有大鼠足爪肿胀度、关节炎指数、血清炎症细胞因子及类风湿因子(RF)、5-羟色氨酸(5-HTP)水平、血清氧化应激相关指标水平。结果治疗后，与模型对照组比较，各组大鼠d 16、d 20、d 24时足爪肿胀度较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)；各组大鼠d 16、d 20、d 24时关节炎指数(arthritis index，AI)评分较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)；各组大鼠ESR及血清C反应蛋白(CRP)、RF、5-HTP水平较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)；各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6水平较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)；血清IL-2水平较高，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组>丹皮酚低剂量组(P<0.05)；各组大鼠血清丙二醛(MDA)、NO水平较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组； 超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平较高，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组>丹皮酚低剂量组(P<0.05)。结论丹皮酚能够明显降低AA大鼠模型血清5-HTP及IL-1、IL-6水平，提高血清IL-2水平，发挥抗炎镇痛作用，同时能够抑制氧化应激反应，作用具有剂量依赖性。

佐剂性关节炎大鼠模型；丹皮酚；关节炎指数；5-羟色氨酸；白介素族

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性全身自身免疫性疾病，主要表现初期为关节肿胀、游走性疼痛、晨僵、活动受限等，晚期可发展为关节畸形[1]。RA在40～60岁女性人群高发，全世界发病率为0.5%～1%，在我国约为0.4%～1.0%，且呈逐年上升趋势[2]，未规范治疗的患者3年致残率高达70%[3]，可见，RA具有发病率高、致残率高等特点，对患者的生活质量和身心健康造成严重影响。该病病程较长，迁延难愈，目前尚无特效疗法，临床上主要采用非甾类抗炎药、抗风湿药、糖皮质激素、中药制剂等进行治疗[4]，前三类药物往往副作用较大，而中药制剂以作用靶点多、安全性高等特点具有独特优势。丹皮酚提取自中药丹皮，具有解热、镇痛、抗炎、保护肝肾、抗肿瘤等多种作用[5]。本研究主要探讨丹皮酚对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型5-羟色氨酸及白介素族的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：选取4周龄SPF级健康SD大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002)100只，雌雄各半，体质量90.10～97.83g，平均体质量(95.43±12.45)g。将大鼠置于鼠笼中，采用自然光照，温度控制在18 ℃～22 ℃，湿度约50%，给予充足饮水、标准饲料，自由活动与进食，进行适应性饲养1周。

1.1.2 主要药品与试剂：丹皮酚，购自南京春秋生物工程有限公司，纯度≥98%，CAS编号：552-41-0；雷公藤多苷片，购自江苏美通制药有限公司，国药准字Z32021007；弗氏完全免疫佐剂(含卡介苗)(Freund’s complete adjuvant，FCA)，购自上海北诺生物科技有限公司；戊巴比妥钠，购自北京普博斯生物科技有限公司；C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、类风湿因子(rheumatoid factors，RF)、5-羟色氨酸( 5-Hydroxytryptophan，5-HTP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin 1，IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA检测试剂盒，购自上海岚派生物科技有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(TBA法)，购自上海信裕生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒、NO检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxydase，GSH-PX)测定试剂盒(比色法)，上海索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备：Allegra X-5台式离心机、AU5800全自动生化分析仪，美国贝克曼库尔特有限公司产品； Thermo 902-ULTS超低温冰箱，美国赛默飞世尔科技公司产品；AP-960全自动酶联免疫分析仪，日本协和医药株式会社产品。

1.2 方法

1.2.1 造模及实验方法[6]：将所有大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组共5组，每组各20只，雌雄各半。模型组、雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠分别给予FCA 0.1 mL左后足趾皮内注射致炎，空白对照组大鼠给予0.1 mL 0.9% NaCl溶液左后足趾皮内注射，观察到足趾出现继发性免疫炎症反应，表现为对侧后肢及双前肢足爪肿胀且进行性加重，有炎性结节、红斑出现，分布于尾部及耳部，提示AA大鼠模型建立成功；致炎12 d后，采用灌胃给药方式，雷公藤多苷组给予浓度为10 mg/mL雷公藤多苷10 mL/(kg·d)，丹皮酚高剂量组给予浓度为20 mg/mL的丹皮酚10 mL/(kg·d)，丹皮酚低剂量组给予浓度为10 mg/mL的丹皮酚10 mL/(kg·d)，空白对照组、模型组分别给予0.9%NaCl溶液10 mL/(kg·d)；连续给药12 d。实验过程中，无大鼠意外死亡情况发生。

1.2.2 足爪肿胀度及关节炎指数评分观察：分别于d 12、d 16、d 20、d 24，观察足爪肿胀度及关节炎指数评分。采用排水法[7]检测右踝关节(非致炎侧)容积，肿胀度=致炎后关节容积-致炎前关节容积；关节炎指数(arthritis index，AI)评分标准[8]：踝关节无异常为0分；小趾关节红肿为1分；趾关节、足趾均发生肿胀为2分；踝关节以下的足爪发生肿胀为3分；全部足爪肿胀(包括踝关节)为4分。大鼠的AI为各个关节积分总和。

1.2.3 标本取材：最后一次用药结束后4 h，采用3%戊巴比妥钠0.3 mL/kg对大鼠进行麻醉，取颈总动脉血，取2 mL置于抗凝管中，采用魏氏法观测红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)情况；剩余血液放置20min，采用离心机3000r/min离心10min分离血清，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 血清炎症细胞因子及RF、5-HTP水平检测：取3mL大鼠血清，采用全自动酶联免疫分析仪，按照试剂盒说明书操作，通过ELISA法检测血清CRP、RF、5-HTP、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平。

1.2.5 血清氧化应激相关指标水平：取3 mL大鼠血清，采用全自动生化分析仪，按照试剂盒说明书操作，检测血清MDA、SOD、 NO 、GSH-PX水平。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间足爪肿胀度比较 与空白对照组比较，各组大鼠d 12、d 16、d 20、d 24时的足爪肿胀度较高(P<0.05)；与模型组比较，d 16、d 20、d 24时雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠足爪肿胀度较低(P<0.05)，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间足爪肿胀度比较Tab.1 Comparison of foot swelling degree among each group at different

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared withmodel group；△P<0.05，与雷公藤多苷组比较，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，与丹皮酚高剂量组比较，compared withpaeonol high dose group

2.2 各组大鼠不同时间AI评分比较 与模型组比较，d 16、d 20、d 24时雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠的AI评分较低(P<0.05)，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠不同时间AI评分比较分)Tab.2 Comparison of AI evaluation among each group at different time points (n=20，±s， points)

#P<0.05，与模型组比较，compared withmodel group；△P<0.05，与雷公藤多苷组比较，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，与丹皮酚高剂量组比较，compared withpaeonol high dose group

2.3 各组大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平比较 与空白对照组比较，各组大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平较高(P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平较低(P<0.05)，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平比较Tab.3 Comparison of serum CRP, RF and 5-HTP levels among each group at different time points(n=20，±s)

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared withmodel group；△P<0.05，与雷公藤多苷组比较，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，与丹皮酚高剂量组比较，compared withpaeonol high dose group

2.4 各组大鼠血清炎症因子水平比较 与空白对照组比较，各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平较高(P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平较低，血清IL-2水平较高(P<0.05)，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组血清TNF-α、IL-1、IL-6水平低于丹皮酚低剂量组，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组血清IL-2水平高于丹皮酚低剂量组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平比较Tab.4 Comparison of serum TNF-α,IL-1,IL-2 and IL-6 levels among each group at different time points (n=20，±s， pg/mL)

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared withmodel group；△P<0.05，与雷公藤多苷组比较，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，与丹皮酚高剂量组比较，compared withpaeonol high dose group

2.5 各组大鼠血清氧化应激相关指标水平比较 与空白对照组比较，各组大鼠血清MDA、NO水平较高，SOD、GSH-PX水平较低(P<0.05)；与模型组比较，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠血清MDA、NO水平较低，SOD、GSH-PX水平较高(P<0.05)，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组血清MDA、NO水平低于丹皮酚低剂量组，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组血清SOD、GSH-PX水平高于丹皮酚低剂量组(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠血清MDA、SOD、NO、GSH-PX水平比较Tab.5 Comparison of serum MDA,SOD,NO and GSH-PX levels among each group at different time points (n=20，±s)

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with normal control group；#P<0.05，与模型组比较，compared withmodel group；△P<0.05，与雷公藤多苷组比较，compared with tripterygium glycosides group；▲P<0.05，与丹皮酚高剂量组比较，compared withpaeonol high dose group

3 讨论

丹皮酚是中药丹皮的有效成分[9]，丹皮能够凉血清热、活血化瘀，药理研究显示，丹皮酚药理作用多样，能够保护肝肾、抗菌消炎、镇痛、抗肿瘤、清除自由基、抗抗过敏、保护心血管等[10]。Hyuk Soon Kim等[11]采用丹皮酚干预体外反转录聚合酶作用下的炎症反应，结果发现，其能够有效抑制炎症反应相关基因的表达；颜贵明等[12]采用丹皮酚对内毒素致慢性阻塞性肺疾病大鼠模型进行干预，结果发现丹皮酚能够通过抗炎、抗氧化等作用抑制大鼠气道重构。可见，丹皮酚确实具有良好的抗炎作用，但关于其治疗RA的研究尚不多见，所以，本次研究采用弗氏完全免疫佐剂局部注射致炎建立AA大鼠模型，来探讨丹皮酚对RA的影响。本研究结果显示，与模型组比较，d 16、d 20、d 24时雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠足爪肿胀度及AI评分较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)，表明丹皮酚能够有效抑制模型大鼠继发性炎症，减轻关节肿胀症状，且作用效果与剂量正相关。

ESR、CRP、RF是RA常见的实验室检查指标，对RA有早期诊断价值[13]。ESR为红细胞沉降率，其水平类风湿的活动度正相关，可以用来评价RA活动度以及治疗效果；CRP是急性时相蛋白，是反映炎症反应程度的早期、敏感指标，临床意义与ESR一致；RA是一种自身免疫性疾病，RF则是将自身免疫球蛋白作为靶抗原的自身抗体，参与炎症反应，是诊断RA常规检查指标[14]。5-HTP 是5-羟色胺(5-HT)的前体物质，可以反映5-HT的水平，而5-HT为一种神经递质，也是外周致痛因子，能够刺激神经末梢直接导致疼痛的产生[15]。本研究结果显示，与模型组比较，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠ESR及血清CRP、RF、5-HTP水平较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组(P<0.05)，表明丹皮酚具有良好的抑制炎症活动度及镇痛作用。

炎症反应是RA最主要的病理变化，白细胞介素及TNF-α是参与炎症反应常见的细胞因子。IL-1及TNF-α具有激活血管内皮细胞，促进其与粘附分子结合，加重炎症反应的作用；IL-6能够促进B细胞增殖、分泌抗体诱发炎症反应及免疫功能紊乱；三者均为促炎细胞因子；IL-2则属于T细胞生长因子，可以调控免疫应答，其水平升高可减慢炎性细胞因子的致炎效应[16]。本研究结果显示，与模型组比较，雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组、低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平较低，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组；血清IL-2水平较高，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组>丹皮酚低剂量组(P<0.05)，表明苦参碱能够降低AA大鼠模型血清TNF-α、IL-1、IL-6水平，提高血清IL-2水平，有效减轻炎症反应。

氧化应激反应也在RA关节损伤过程中起到重要作用[17]。MDA是脂质过氧化产物，NO具有自由基特征，可产生细胞毒性诱发免疫损伤，二者与氧化应激反应程度正相关；SOD、GSH-PX均具有清除自由基的功能，其水平可以反映机体抗氧化能力。本研究结果显示，与模型组比较，各组大鼠血清MDA、NO水平较低，SOD、GSH-PX水平较高，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组，血清MDA、NO水平低于丹皮酚低剂量组，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组<丹皮酚低剂量组；雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组血清SOD、GSH-PX水平高于丹皮酚低剂量组，其中雷公藤多苷组、丹皮酚高剂量组>丹皮酚低剂量组(P<0.05)，表明丹皮酚能够减轻AA大鼠氧化应激反应，减少其造成的组织损伤。

综上所述，丹皮酚能够明显降低AA大鼠模型血清5-HTP及IL-1、IL-6水平，提高血清IL-2水平，发挥抗炎镇痛作用，同时能够抑制氧化应激反应，作用具有剂量依赖性，为丹皮酚用于RA的治疗提供实验基础。

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(编校：王俨俨)

Effectofpaeonolon5-hydroxytryptophanandinterleukinfamilyofadjuvantarthritisratmodelwitharthritis

SHI Lei1, WANG Jian-jie2, ZHOU Cheng-fu1,2Δ
(1.Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China; 2. School of Basic Medical Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

ObjectiveTo analysis the effect of Paeonol on 5- hydroxytryptophan(5-HTP) and interleukin family of adjuvant arthritis (AA) rat model.MethodsOne hundred SD rats were randomly divided into normal control group, model group, tripterygium glycosides group, paeonol high dose group and low dose group, each with 20 rats, half male and female. AA rat models were established by left toe after intradermal injection of complete Freund’s adjuvant in each group, and were given corresponding drug treatment. The foot swelling degree, arthritis index, serum inflammatory cytokines, rheumatoid factors (RF) and 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) levels, and serum oxidative stress related indexes levels were detected.ResultsAfter treatment, compared with model control group, the foot swelling degree of the rats on time d16,d20,d24 in each group were lower, tripterygium glycosides group,paeonol high dose grouppaeonol low dose group (P<0.05); the serum levels of malondialdehyde (MDA), NO of the rats in each group were lower, tripterygium glycosides group,paeonol high dose grouppaeonol low dose group (P<0.05).ConclusionThe paeonol can effectively reduce the serum levels of 5-HTP and IL-1,IL-6, improve the serum level of IL-2, exert anti-inflammatory and analgesic effects, can inhibit the oxidative stress reaction at the same time, and the effect was dose dependent.

adjuvant arthritis rat model; paeonol; arthritis index; 5- hydroxytryptophan; interleukin family

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.007

黑龙江省卫生厅科研课题(2013250)

石磊，男，硕士，主任医师，研究方向；脊柱关节外科，E-mail：shileivip126@126.com；周成福，通信作者，本科，主任医师，研究方向：关节外科，E-mail：zhouchengfu_dr@126.com。

R684.3；R285.5

A