小黄鱼精液超低温冷冻保存技术的试验研究

王肇霖，陈睿毅，楼　宝，詹　炜，徐冬冬，王立改，刘　峰

（1.浙江海洋学院水产学院，浙江舟山　316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山　316021）

小黄鱼精液超低温冷冻保存技术的试验研究

王肇霖1，陈睿毅2，楼宝2，詹炜2，徐冬冬2，王立改1，刘峰1

（1.浙江海洋学院水产学院，浙江舟山316022；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021）

摘要：为了研究小黄鱼精液超低温冷冻保存技术，分别比较了3种抗冻剂、3种降温方法和2种复温温度对冷冻精液的影响。结果表明：采用Riger's液作为稀释液、10%DMSO为抗冻剂，冷冻精液的激活率和受精率最高，与其他两个实验组差异显著（P＜0.05），分别为92.36%和81.36%；以10℃/min的降温速率将精液降至-80℃后液氮保存，40℃水浴解冻比室温解冻可以获得更好的受精效果，受精率和孵化率分别为78.47%和75.47%。

关键词：小黄鱼；精液；超低温

小黄鱼Larimichthys polyactis Bleeker，又名小鲜、黄花鱼等，为石首鱼科小黄鱼属鱼类，其广泛分布于我国东海、黄海和渤海以及朝鲜半岛西岸的近海海域，属暖温性近底层鱼类。自上世纪70年代以来，受过

1材料与方法

1.1小黄鱼来源

2014年4月初，从宁波象山石浦港湾海域收集野生小黄鱼1 000余尾，体长约2 cm。用活水船转移到浙江省海洋水产研究所试验场进行室内车间养殖，饵料为鱼宝牌配合饲料。2015年2月份开始投喂牡蛎，并辅以VC和VE，至4月份性成熟，测量小黄鱼平均体重为112±28 g，体长4～5.5 cm。

1.2小黄鱼精卵采集

将不同抗冻剂、降温方式和复温方式处理后的小黄鱼精子分成若干组。设置受精率和孵化率两个指标来检测不同组别冷冻保存精子的活力。采集小黄鱼的卵子，与不同组别的精子进行人工授精得到受精率和孵化率。2015年4月下旬，小黄鱼性腺发育成熟，此时雄鱼轻压腹部即有精液流出，用不同方法进行保存；挑选腹部膨大柔软的雌性小黄鱼进行人工催产，催产素为LHRH-A2和HCG，剂量为1.2 μg/kg和500 IU/kg，催产36 h后即可人工取卵，置于洁净干燥的烧杯中，冰盘避光保存，保存时间一般应少于30 min。

1.3小黄鱼精子抗冻剂的筛选

小黄鱼精子冷冻保存液由精子稀释液和抗冻剂组成，两者的体积比为9∶1。精子稀释液参考Riger's液的配方，略有改动，见表1，抗冻剂选取甘油（GLY）、二甲基亚砜（DMSO）和丙二醇（EG）。将新鲜的小黄鱼精液与精子冷冻保存液按1∶4的比例混匀，装入1.5 mL的离心管中，4℃下静置10 min后，以10℃/min的速度将温度降至-80℃，平衡2 min后液氮中保存24 h，然后40℃水浴解冻，参考江世贵等［4］的方法计算精子激活率，然后进行人工授精，计算受精率，鲜精作为对照组，每组均设3个平行。

表1　小黄鱼精子稀释液成分表Tab.1　Larimichthys polyactis semen diluent ingredient

1.4降温方式的筛选

用DMSO含量为10%的精子冷冻保存液按4∶1的比例稀释小黄鱼精液后，装入1.5 mL的离心管中（每支装1.0 mL），4℃下静置10 min。按表2的方法对不同实验组进行降温，液氮中保存24 h后，40℃水浴解冻，然后按精卵体积比1∶20的比例进行人工授精，统计各组受精率和孵化率，设鲜精作为对照组，每组均3个平行。

表2　小黄鱼精液降温程序Tab.2　L.polyactis semen cooling process

1.5解冻方法的筛选

将小黄鱼精液与10%DMSO的精子保存液按4∶1的比例混匀后，4℃下静置10 min，然后以10℃/min的速度将温度降至-80℃，平衡2 min后转入液氮中进行保存，24 h后分别在常温（21℃）和40℃水浴下解冻，统计各组受精率和孵化率，每组均设3个平行。

1.6数据处理与分析

精子激活率是指精液与过滤海水混合后，于显微镜下观察到的运动精子数量与全部精子数量之比；受精率为囊胚个体数与受精卵总数之比；孵化率为出膜个体数与囊胚个体数之比，数据分析使用软件SPSS19.0进行，用单因素分析法对数据（Duncan氏多重比较）进行差异显著性比较。

2实验结果

2.1抗冻剂对精子激活率的影响

小黄鱼鲜精与冻精的激活率与受精率结果见表3。在3种抗冻剂保存的冻精中，DMSO组的激活率和受精率最高，分别为92.36%和81.36%，EG和GLY次之。其中，10%DMSO保存的冻精组与鲜精对照组的激活率之间不存在显著差异（P＞0.05），但与EG组和GLY组受精率存在显著差异（P＜0.05）。而在受精率方面，DMSO组与EG组之间不存在显著差异（P＞0.05），与鲜精组和GLY组存在显著差异（P＜0.05）。

表3　小黄鱼鲜精与冻精的激活率与受精率Tab.3　L.polyactis fresh essence and frozen activation rate and fertilization rate

2.2降温方式对精子活力的影响

不同降温方式对小黄鱼受精率和孵化率的影响如图1。从图1可以看出，鲜精的受精率和孵化率最高，分别为78.65%和73.54%，Ⅲ组次之，Ⅱ组最低。3个实验组中，Ⅲ组的受精率和孵化率最高，分别为均72.79%和61.83%，且与其他两组存在显著差异（P＜0.05），表明该种降温方式对小黄鱼精液的影响较小，以该种方式对小黄鱼精液进行冷冻保存较为合适。

2.3解冻温度对精子活力的影响

在不同的温度下对小黄鱼冷冻精液进行解冻，人工授精后，结果如图2。从图2可以看出，鲜精的受精率和孵化率最高，40℃水浴解冻组次之，分别为78.47%和75.47%，室温解冻组最低，分别为72.56%和70.32%。40℃水浴解冻组和室温解冻组之间存在显著差异（P＜0.05），表明以-10℃/min的速度将精液温度降至-80℃后投氮保存，使用时40℃水浴解冻对精子损伤较小，授精可获得理想效果。

图1　降温方式对小黄鱼精子活力的影响Fig.1　The influence of cooling way of Larimichthys polyactis sperm vitality

图2　解冻方法对小黄鱼精子活力的影响Fig.2　The influence of thawing method of L.polyactis sperm vitality

3讨论

3.1抗冻剂的选择

抗冻保护剂的选取是进行精子超低温冷冻保存过程中至关重要的部分，它可以在一定程度上抑制或降低降温过程中水冰晶的形成，阻止水冰晶对于精子的机械损伤，从而达到抗冻的目的［2］。目前，常用的抗冻剂主要有甲醇（MeOH）、乙二醇（EG）、甘油（GLY）、二甲基亚砜（DMSO）和丙二醇（PG）等［3-4］。程顺等［5］采用GLY作为抗冻剂对大黄鱼精液进行冷冻保存，发现5%～20%GLY为抗冻剂，冷冻保存效果最佳，冻精活力与鲜精活力无显著差异。魏平等［8］使用5%～25%的DMSO和10%～20%的EG为抗冻剂，超低温冻存真鲷精子的效果较佳，冻精核DNA损伤较轻。参考大黄鱼的相关研究［6］，本实验中将抗冻剂的比例设为10%，并选取了EG、GLY和DMSO 3种抗冻剂进行抗冻实验，结果显示，相同的降温和解冻方法下，10%DMSO抗冻效果最好，获得了92.36%和81.36%的受精率和孵化率。相关研究表明［7］，DMSO是比较有效的鱼类精子冷冻抗冻剂，10%DMSO是一个高度有效的浓度，既能起到良好的抗冻作用，又不会因抗冻剂浓度过高而导致精子中毒，适合于多种鱼类精子冷冻保存［8］。

3.2降温方式的选择

对于鱼类精子而言，鱼类精子冷冻保存时所受的损伤主要在于冷冻和复苏两个步骤，而冰晶则是冷冻过程中的最大危害因素［9］。目前，鱼类精子冷冻保存多采用分段降温法，一种是以一定的降温速率将精液降至某一临界温度，稳定数分钟后再投氮保存，如虹鳟Oncorhynchus mykiss［9］、尖吻鲈Lates calcarifer［9］和大黄鱼［10］等；另一种是将精液停留在离液氮面某一高度数分钟后投氮保存，如真鲷［5］、鮸鱼［11］和黄姑鱼［12］。本实验中，以-10℃/min的速率将精液降温至-80℃，稳定2 min后投氮保存，效果最佳，这一结果也与大黄鱼的研究结果相似［9］。本实验采用的降温方式有利于精子对低温的适应，能够在冻结前充分脱水，减少冰晶形成，安全越过-15～-60℃这段危险温度区。当然，由于鱼的种类、所用抗冻剂和稀释液存在差异，每种鱼的最适降温速率也不应一概而论，应根据实际情况进行相应调整。

3.3解冻温度的选择

研究表明，冷冻精液的解冻温度与降温速率具有很大的相关性，较慢的降温速率搭配较慢的解冻速率，可以获得较好的解冻效果［9］。本实验中，采用10℃/min的速率进行降温，搭配40℃水浴下解冻效果最好，说明，对于小黄鱼而言，使用10℃/min的降温速率和40℃解冻温度对小黄鱼精子损伤较小，可以获得较为理想的受精率和孵化率。刘清华［13］对真鲷精子进行冷冻研究发现，以20℃/min的降温速率，40℃水浴解冻，受精率和孵化率最高；肖志忠等［10］以20℃/min的速率对大黄鱼精子进行超低温保存43℃水浴解冻后，冻精和鲜精的受精率和孵化率相似。鱼类精液冷冻保存方法的选择受多方面因素的影响，同时由于鱼类精子具有独特的激活机制，还要加强对冷冻过程中线粒体的损伤机制及鱼类精子运动分子机理进行深入研究。

参考文献：

［1］姜静.几种海水鱼类种质超低温冷冻保存研究［D］.上海:上海海洋大学，2014.

［2］陈亚坤.超低温保存对真鲷精子质量的影响［D］.青岛:中科院海洋研究所，2010.

［3］程顺，严家强，竺俊全，等.甘油为抗冻剂超低温冷冻保存大黄鱼精子的DNA损伤［J］.中国畜牧杂志，2013，49（11）:34-36.

［4］江世贵，苏天凤，喻达辉，等.中华乌塘鳢精子的生物学特性及其超低温保存［J］.水产学报，2000，24（2）:119-122.

［5］魏平，竺俊全，闫家强，等.真鲷精子的超低温冻存及DNA损伤的检测［J］.水生生物学报，2010，34（5）:1 049-1 055.

［6］姜建湖，闫家强，竺俊全，等.大黄鱼精子的超低温冻存及细胞结构损伤的检测［J］.农业生物技术学报，2011，19（4）:725-733.

［7］陈松林.鱼类精子和胚胎冷冻保存理论与技术［M］.北京:中国农业出版社，2001.

［8］采克俊，曹访，叶金云.鱼类精子低温冷冻保存研究进展［J］.湖州师范学院学报，2012，34（2）:26-30.

［9］汪小锋，樊廷俊.鱼类精子冷冻保存的研究进展［J］.海洋科学，2003，27（7）:18-31.

［10］肖志忠，陈雄芳，丁福红，等.大黄鱼精液的高效超低温保存［J］.海洋科学，2007，31（4）:1-4.

［11］王伟，叶霆，闫家强，等.鮸鱼精子的生理特性及超低温冻存［J］.生物学杂志，2010，27（6）:13-16.

［12］金春华，闫家强，竺俊全.黄姑鱼精子的超低温冻存及细胞结构损伤的检测［J］.水产学报，2011，35（6）:846-853.

［13］刘清华.真鲷（Pagrosomus major）精液超低温保存及其低温损伤研究［D］.青岛:中国海洋大学，2005.

中图分类号：S961.2+2

文献标识码：A

文章编号:1008-830X（2016）01-0015-04

收稿日期：2015-12-23

基金项目：浙江省科技计划项目（2015F50006）；舟山市科技计划项目（2014C31061）；象山县科技计划项目（2015C0014）

作者简介：王肇霖（1992-），女，江苏南京人，硕士研究生，研究方向：鱼类遗传育种.E-mail:s92922@sina.com

通讯作者：楼宝（1969-），男，浙江义乌人，教授，研究方向：海水鱼类繁殖及遗传育种.E-mail:loubao6577@163.com度捕捞和环境恶化等因素的影响，小黄鱼产量逐年减少，捕获多为体重小于100 g的幼鱼，开展小黄鱼精液冷冻保存技术的研究，将品质优良的小黄鱼精液保存起来，可以为遗传多样性的保护提供技术支持，同时可以为遗传育种、远缘杂交和隔代回交等研究提供材料［1］。近年来，国内外针对鱼类精子冷冻保存技术进行了相关研究，如大黄鱼Larimichthys crocea、斑鳜Siniperca scherzeri、真鲷Pagrosomus major精子等［2-3］。本文通过比较筛选抗冻剂的种类、比例以及降温和复温方法对冷冻小黄鱼受精率和孵化率的影响等进行研究，以期得到最佳的小黄鱼精子冷冻保存方法，为小黄鱼的人工繁殖技术的发展提供基础资料。

The Study of Larimichthys polyactis Spermatozoa Cryopreservation

WANG Zhao-lin1，CHEN Rui-yi2，LOU Bao2，et al
（1.Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022；2.Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Zhoushan316021，China）

Abstract:In order to develop a method for spermatozoa cryopreservation of Larimichthys polyactis，we compared the effect of three different antifreeze，three different cooling methods and two thawing temperature on the frozen spermatozoa，respectively.The results showed that，the activation of frozen spermatozoa rate and fertilization rate were highest using the Riger's as diluent and 10%DMSO as antifreeze.The activation rate and fertilization rate are 92.36%and 81.36%respectively，which were significant higher than those in the other 2 experimental groups（P＜0.05）.The best cryopreservation were obtained at the rate of at the speed of 10℃/ min and then kept them in the liquid nitrogen for preservation.The better thawing effect of frozen sperm were got using the water bath at 40℃ than at room temperature.Using the water bath，the fertilization rate and hatching rate were 78.47%and 75.47%，respectively.

Key words：Larimichthys polyactis；spermatozoa；cryopreservation