哮喘患儿外周血巨噬细胞M1/M2极化状态研究

陈　娜　庞保东

(唐山市妇幼保健院儿内科,唐山063000)



哮喘患儿外周血巨噬细胞M1/M2极化状态研究

陈娜庞保东

(唐山市妇幼保健院儿内科,唐山063000)

目的：体外培养哮喘患儿外周血巨噬细胞，并从细胞的表型和功能方面观察巨噬细胞M1/M2极化状态的变化，从而探讨巨噬细胞在哮喘发病中的作用。 方法：选取50例健康对照者与50例哮喘患儿，收集哮喘患儿及健康对照组的血液，分离纯化得到巨噬细胞，体外给予10 ng/ml GM-CSF的血清培养液培养，并在第7天，收集细胞及上清，运用流式细胞技术检测巨噬细胞表型表达，ELISA方法检测细胞上清IL-10、 IL-12含量变化，检测巨噬细胞吞噬外来性抗原及刺激淋巴细胞分化的能力。 结果：与健康对照组相比，哮喘患儿外周血巨噬细胞表面表达的共刺激分子CD64、CD11c、CD40明显降低，CD206、CD14及CD23明显升高(P均<0.05)；患儿巨噬细胞分泌的IL-10明显降低(P<0.05)，IL-12与对照组相比无显著变化(P>0.05)；外周血巨噬细胞吞噬能力明显降低(P<0.05)；将患儿巨噬细胞与T淋巴细胞共培养，IL-4含量明显升高，IFN-γ含量明显降低(P均<0.05)。 结论：相比于健康对照组，哮喘患儿外周血巨噬细胞呈现M2型，提示巨噬细胞与哮喘疾病具有很大的相关性。

巨噬细胞；哮喘；表型

哮喘是一种由多种因素导致的复杂性疾病，其致病机制至今未明，但多种研究认为其与免疫因素密切相关[1]。巨噬细胞作为机体内重要的固有免疫细胞，在机体起着重要作用。根据活化后功能的不同，巨噬细胞可分为M1及M2型巨噬细胞，不同的巨噬细胞可诱发不同的T细胞免疫应答。已经明确的是，哮喘患儿体内存在Th1/Th2亚群失衡，且Th2占优势[2]，鉴于巨噬细胞在免疫系统中的重要作用，我们推测巨噬细胞在哮喘患儿的发病机制中起到了重要的作用。因此，本研究提取哮喘患儿的外周血，分离纯化得到巨噬细胞，观察巨噬细胞的表型和功能的变化，来探讨巨噬细胞在哮喘疾病发生发展中的意义。

1　资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料(1)实验组：选取2013年1月到2015年6月在我院儿科就诊的哮喘患儿50例，其中男30例，女20例，年龄为2～6岁，平均(4.9±7.6)岁。患儿病情符合中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的哮喘诊断标准[3]，为急性发作者,此次发作前4周已停用糖皮质激素等免疫抑制剂，患儿均无严重心、肝疾病史，近期无呼吸道感染 ，排除患儿自身存在风湿性关节炎、系统性血管炎等其他风湿性免疫性疾病，病毒性肝炎、心梗、糖尿病等影响免疫系统的疾病，并排除入院3月来使用激素或免疫抑制剂及免疫调节药物的患儿。(2)对照组：选取门诊查体的健康患儿50例，其中男性28例，女性22例，年龄为2～7岁，平均(4.2±6.5)岁。对照组患儿不存在哮喘的临床症状，无严重心、肝疾病史，近期无呼吸道感染，无糖皮质激素等免疫抑制剂使用史。实验组与对照组在性别、年龄等方面差异不存在统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本实验研究符合本单位的伦理学标准并得到批准，且已获得患儿与监护人的知情同意。

1.1.2主要试剂人单核细胞分离液试剂盒购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，GM-CSF细胞因子购于Peprotech公司，流式抗体CD64、CD11c、CD40、CD206、CD14及CD23及IL-10、 IL-12、IL-4及IFN-γ酶联免疫试剂盒均购于ebioscience公司，异硫氰酸酯(FITC)标记的右旋糖苷(dextran)购于Sigma公司。

1.1.3标本采集分别收集对照组及实验组哮喘发作后立即抽取血液标本8 ml，肝素抗凝。

1.2方法

1.2.1巨噬细胞的分离培养将血液标本与PBS缓冲液倍比稀释混匀，严格按照人单核细胞分离液试剂盒说明书步骤进行操作，将混合液轻轻置于分离液上，4℃，3 000 r/min，离心30 min。轻轻取出离心管，此时会出现分层，将第二层白膜细胞吸出置于另一离心管中，加入PBS清洗，获得单个核细胞备用。配置含有10%胎牛血清的1640培养基，并加入GM-CSF细胞因子，终浓度为10 ng/ml。将获得的单个核细胞用上述联合培养基重悬，于6孔板中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后全量换液，弃去漂浮的细胞，并再加入上述联合培养基继续培养，隔天进行半量换液。继续培养至第7天，细胞刮刀刮取收集细胞及上清用于实验检测。

1.2.2流式细胞仪检测细胞表型收集培养第7天的细胞，与用异硫氰酸酯(FITC)或藻红沅素(PE)标记的流式抗体CD64、CD11c、CD40、CD206、CD14及CD23混合，4℃孵育30 min，PBS洗涤2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重悬后，上流式细胞仪进行检测，记录结果为阳性细胞所占的比例。

1.2.3细胞因子检测 收集培养第7天的细胞上清，严格按照试剂盒说明书，应用IL-10、 IL-12、IL-4及IFN-γ 酶联免疫试剂盒，检测上清细胞因子含量。

1.2.4同种混合淋巴细胞反应取健康志愿者外周血10 ml，经过淋巴细胞分离液梯度离心后获取单个核细胞，PBS洗涤后，于培养皿中培养，置于37℃、5%CO2培养箱中，24 h后收集悬浮细胞，视其为T淋巴细胞。将收集培养第7天的巨噬细胞用丝裂霉素C 25 μg/ml，处理 45 min后用PBS洗涤收集细胞，用10%胎牛血清的1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106ml-1，取100 μl置于96孔板中。并将淋巴细胞也用10%胎牛血清的1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106ml-1，也取100 μl置于96孔板中，使巨噬细胞与淋巴细胞混合的最终容积为200 μl，然后置于37℃、5%CO2培养箱培养72 h。于培养结束时取细胞上清细胞因子分泌来检测T淋巴细胞分化状况。

1.2.5吞噬功能检测收集培养第7天的细胞，应用PBS溶液调整细胞浓度为1×106ml-1，取100 μl置于流式管中，每管加入10 μl用异硫氰酸酯(FITC)标记的抗体右旋糖苷 ，斡旋混匀，4℃孵育50 min，PBS洗涤2次后，每管加入300 μl的PBS溶液重悬后，上流式细胞仪进行检测，记录结果为阳性细胞所占的比例。

2　结果

2.1各组对象外周血巨噬细胞表面共刺激分子表达哮喘患儿与对照组相比，外周血巨噬细胞表面表达的CD64、CD11c、CD40明显低于对照组，CD206、CD14及CD23明显高于对照组，各组差异均存在统计学意义(P<0.05)，具体见表1。

2.2各组对象外周血巨噬细胞细胞因子分泌哮喘患儿与对照组相比，外周血巨噬细胞分泌的IL-10明显低于对照组存在统计学意义(P<0.05)，分泌的IL-12与对照组相比无显著差异(P>0.05)，具体见表2。

2.3各组对象外周血巨噬细胞吞噬能力哮喘患儿与对照组相比，外周血巨噬细胞吞噬能力明显低于对照组，均存在统计学意义(P<0.05)，具体见表3。

表1　各组对象外周血巨噬细胞表面共刺激分子表达变化±s,n=50)Tab.1　Phenotype expression of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表2　各组对象外周血巨噬细胞细胞因子分泌变化±s,n=50)Tab.2　Cytokine secretion of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表3　各组对象外周血巨噬细胞吞噬能力±s,n=50)Tab.3　Phagocytic capacity of macrophagocyte in each ±s,n=50)

表4　各组对象外周血巨噬细胞刺激T淋巴细胞分泌细胞因子±s,n=50)Tab.4　Cytokine secretion of T lymphocyte in each ±s,n=50)

2.4各组对象外周血巨噬细胞刺激T淋巴细胞分化哮喘患儿与对照组相比，外周血巨噬细胞刺激T淋巴细胞分泌IL-4含量明显高于对照组，IFN-γ含量明显低于对照组，各组差异均存在统计学意义(P<0.05)，具体见表4。

3　讨论

支气管哮喘是由多种细胞，如嗜酸粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞等浸润为主的气道慢性变态反应性炎症,其中T淋巴细胞是最重要的致病性细胞。目前普遍认为，Th1/Th2细胞失衡，Th2占优势与哮喘发病密切相关[4]。Th1细胞主要分泌IL-12、IFN-γ等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，可提高巨噬细胞的吞噬能力[5]。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等，介导抗体生成和寄生虫免疫，参与体液免疫，在感染和环境变应原的应答中起重要作用[6]。有研究发现，CD4+T细胞仅在过敏原存在的情况下，并不能导致Th1/Th2细胞失衡，而在巨噬细胞共培养的情况下，Th2优势明显增加，T细胞分化即存在失衡，说明了巨噬细胞在哮喘发病中起着重要作用[7]。

巨噬细胞作为体内重要的固有免疫细胞，以往多认为巨噬细胞的主要作用为清除机体损伤、衰老或凋亡的细胞以及抗原性异物，如病原体和免疫复合物等。近年来，随着巨噬细胞生物学特性和功能的深入研究，发现巨噬细胞的功能状态可极大影响T淋巴细胞功能，会直接影响免疫应答的反应，从而影响机体的各种生命活动，因此巨噬细胞的重要性被重新评估和强调。已明确的是，巨噬细胞分为M1及M2型。 M1型巨噬细胞，主要由Th1细胞分泌的细胞因子或脂多糖等诱导生成，表现为抗原提呈功能增强，可分泌多种细胞因子，如IL-12、IL-6以及趋化因子，如CXCL-9、CCL-5等，高表达多种表面因子，如CD64、CD11c、CD40，参与Th1免疫应答，导致炎性损伤，可杀伤体内肿瘤和病原体[8,9]。M2型巨噬细胞，主要由Th2细胞分泌的细胞因子，如IL-4及IL-13等诱导生成，表现为高分泌多种细胞因子，如TNF-α、IL-1清道夫受体以及趋化因子CCL17 和 CCL24 等，高表达多种表面因子，如CD206、CD14及CD23，可促进Th2免疫应答，参与组织的损伤修复和纤维变性[10,11]。目前多数研究认为，在M1及M2型巨噬细胞之间还存在另一种细胞及调节性巨噬细胞，通过高表达IL-10来参与多种疾病的发生发展[11,12]。

本研究可以看出，与健康对照组相比，哮喘患儿外周血巨噬细胞表面表达的共刺激分子CD64、CD11c、CD40明显降低(P<0.05)，CD206、CD14及CD23明显升高(P<0.05)；哮喘患儿巨噬细胞分泌的IL-12与对照组相比无显著变化(P>0.05)。以上结果均提示哮喘患儿外周血巨噬细胞呈现M2型极化。并且，研究发现哮喘患儿外周血巨噬细胞吞噬能力明显低于对照组，提示巨噬细胞在极化变化的情况下，成熟度也明显下降。进一步研究发现，将患儿巨噬细胞与T淋巴细胞共培养，IL-4(Th2细胞因子)含量明显升高，IFN-γ(Th1细胞因子)含量明显降低，即验证了，巨噬细胞可以显著诱导T细胞向Th2极化，从而导致Th1/Th2失衡，诱导疾病生成。与此同时，研究发现哮喘患儿巨噬细胞分泌IL-10明显下降，提示调节性巨噬细胞含量降低，这与多种研究结果基本吻合，其他研究表明哮喘患者肺巨噬细胞IL-10表达量明显下降，并且下降量与疾病的严重程度正相关[13,14]。本研究也提示了哮喘患儿外周血调节性巨噬细胞含量较正常组明显下降,与国内外多项研究吻合。

综上所述，相对于健康对照者，哮喘患儿外周血巨噬细胞呈现M2型分化，由此可见巨噬细胞参与了哮喘疾病的发生与发展，并在其中起着重要作用。

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[收稿2015-11-02修回2016-03-10]

(编辑张晓舟)

Study on polarization of macrophage in peripheral blood of patients with asthma

CHEN-Na,PANG Bao-Dong.Department of Pediatiric Internal Medicine,Tangshan Maternity and Child Health Hospital,Tangshan 063000,China

Objective:To investigate the different function of macrophage between patients with asthma and healthy control, and discuss the pathogenesis of the disease.Methods: Choose 50 healthy controls,50 patients with asthma, and isolation of blood macrophage. Then samples were induced with GM-CSF, and cells were collected on day 7. Macrophage function was evaluated using the following methods: fluorescence-activated cell sorting analysis for cell surface markers and phagocytosis;enzyme-linked immunosorbent assay for cytokine production and the induction of T cell.Results: Compared with the control group, asthma group had decreased CD64, CD11c, CD40 expression, and increased CD206, CD14, CD23 expression(P<0.05);displayed the decreased IL-10 level(P<0.05);displayed a decreased phagocytosis ability(P<0.05);when co-cultured with T cells, the supernatantdisplayed the increased IL-4 expression, and decreased IFN-γ level(P<0.05).Conclusion: Compared with the control group, macrophage in asthma group displayed M2 phenotype, which inditates macrophage play the important role in the pathogenesis of asthma.

Macrophage;Asthma;Polarization

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.028

R256.12文献标志码A

1000-484X(2016)08-1208-04

陈娜(1979年-)，女，副主任医师，主要从事儿科方面的研究。