HSP70-TKD诱导的NK细胞向肿瘤细胞迁移的实验研究①

汪相如　陈蓉明　龚福生　应敏刚　郑秋红

(福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院肿瘤分子研究室，生物治疗重点实验室，福州350014)



HSP70-TKD诱导的NK细胞向肿瘤细胞迁移的实验研究①

汪相如陈蓉明龚福生应敏刚郑秋红

(福建医科大学教学医院福建省肿瘤医院肿瘤分子研究室，生物治疗重点实验室，福州350014)

①本文为福建省医学创新课题(2011-CX-17)。

目的：研究HSP70-TKD诱导的自然杀伤细胞(NK)体外对细胞表面HSP70表达不同的胰腺癌细胞和结肠癌细胞的迁移作用差异。方法：用干细胞培养基富集人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10天加入2 μg/ml TKD，4 d后用流式细胞仪检测NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达情况；应用流式分选将胰腺癌细胞系Colo357和结肠癌细胞系CW2分为HSP70高表达细胞亚系Colo+、CW2+和HSP70低表达细胞亚系Colo-、CW2-；Transwell小室实验检测HSP70-TKD诱导的NK细胞对这4种细胞的迁移能力，MTT法检测HSP70-TKD诱导的NK细胞对这4种细胞的杀伤活性。结果：流式结果显示NK细胞在干细胞培养基中培养14天可大量增殖，细胞纯度最高达(92.50 ±1.25)%； 经HSP70-TKD诱导后，NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达明显增加；经流式分选后，Colo+、Colo-细胞表面HSP70的表达分别为(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,而CW2+、CW2-细胞表面HSP70的表达分别为(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%；HSP70-TKD诱导的NK细胞对Colo+迁移率为(68.6±2.8)%，明显高于对Colo-的迁移率(22.8±1.5)%，NK细胞对CW+迁移率为(73.5±2.7)%，明显高于对CW2-的迁移率(18.2±1.3)%；HSP70-TKD诱导的NK细胞对Colo+、Colo-的杀伤活性有显著性差异，当效靶比为20∶1时，杀伤活性分别为(61.2±3.0)%、(24.5 ±1.5)%， NK对CW2+、CW2-的杀伤活性有显著性差异，当效靶比为20∶1时，杀伤活性分别为(63.8±3.2)%、(22.4±1.8)%。结论：HSP70-TKD诱导的NK细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞，在体外易向HSP70表达阳性的肿瘤细胞迁移。

肿瘤细胞；HSP70-TKD;NK细胞；迁移

自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)是一群不同于T 、B 淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞,分布于外周各淋巴器官及血液循环系统,无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应,并可分泌多种细胞因子及趋化因子。NK细胞不表达TCR或产生抗体，其细胞表达一系列活化性受体及抑制性受体,两者间的平衡是控制NK 细胞是否被激活的重要机制，当活化性受体与相应的配体结合，细胞处于杀伤活化状态，而当抑制性受体与相应的配体结合，细胞处于抑制状态[1,2]。NK细胞表面的抑制性受体与自体细胞表达的MHCⅠ类分子结合，因此不会杀伤自体细胞，而可杀伤丢失MHCⅠ类分子的肿瘤细胞[3]。多种肿瘤细胞表面表达HSP70,原发胰腺癌细胞有64%细胞表面表达HSP70,而相应的正常组织却不表达HSP70[4]。在体外，细胞表面表达的HSP70为NK细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的配体，其中C末端的14个氨基酸序列TKDNNLLGRFELSG(TKD)是暴露在肿瘤的细胞外介质中,是CD94/NKG2C与HSP70的结合位点[5,6]。本课题的前期实验发现HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞裸鼠移植瘤具有明显的抑制作用，且NK细胞能浸润到HSP70高表达的胰腺组织。本文是从体外研究NK细胞对细胞表面HSP70表达不同的肿瘤细胞的迁移作用差异,从而探讨这种迁移作用的机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂淋巴细胞分离液由中国医学科学院研究所提供。干细胞培养基(Stem cell growth medium，SCGM)购自德国CellGro 公司，IL-2 购自上海华新公司，PHA购自华美公司,鼠抗人CD3-FITC、CD56-PE、CD94-FITC、Anti-HSP-70/FITC(2 mg/ml) 购自上海瑞齐生物科技有限公司，RPMI1640培养基、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Gibco公司,HSP70-TKD 由晶美公司合成，纯度>95%，5 μm孔径有基底胶Transwell小室购自BD公司。

1.1.2细胞株人胰腺癌细胞Colo357和人结肠癌细胞CW2购自上海细胞所。

1.2方法

1.2.1NK细胞的扩增及表型分析采集健康人外周血10 ml，肝素抗凝，PBS 等倍稀释后，用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用SCGM(含5%人AB 血清及600 U/ml IL-2)调整PBMC 密度至1×106/ml，接种于6 孔板，2 ml /孔，加入500 ng/ml鼠抗人CD3 单抗和50 μg/ml PHA，置37 ℃、5%CO2培养箱培养。培养3 d 后，3 000 r/min离心4 min(离心半径10 cm)，洗去培养基中的鼠抗人CD3 单抗和PHA，再加入SCGM 继续培养，每3天半量换液。细胞培养14 d 后用流式细胞仪分析细胞的表型特征，1×106个细胞加入10 μl CD3-FITC和CD56-PE，室温暗处结合20 min后，PBS 洗涤2次，用500 ml 的PBS 悬浮细胞，流式细胞仪检测CD3/CD56 表达情况[7]。

1.2.2HSP70-TKD诱导NK细胞表面CD94/NKG2C的表达按照以上的方法培养NK细胞至第10天时，将细胞分成诱导组和未诱导组，诱导组加入100 U/ml IL-2和2 μg/ml TKD，未诱导组加入100 U/ml的IL-2，4 d后流式细胞仪检测NK细胞表面CD94/NKG2C的表达，1×106个细胞分别加入10 μl CD94-FITC，室温暗处结合20 min后，PBS 洗涤2 次，用500 ml的PBS 悬浮细胞，流式细胞仪检测CD94/NKG2C 表达情况。

1.2.3流式细胞分选HSP70阳性的肿瘤细胞处于对数期的人胰腺癌细胞Colo357和人结肠癌细胞CW2经胰酶消化，PBS洗涤2次，用PBS将细胞的浓度调到107个/ml，取500 μl的细胞悬液加入50 μl的Anti-HSP-70/FITC，静置4 ℃冰箱，避光，孵育30 min，PBS洗涤2次,通过细胞滤网后用流式细胞仪检测并分选HSP70+和HSP70-细胞群,流式分选阳性的HSP70+和HSP70-细胞后进行回测，检测HSP70+的百分比。

1.2.4Transwell小室检测NK细胞对HSP70+和HSP70-细胞群的迁移能力将孔径为5 μm的基底胶Transwell小室放入24孔培养板中，上室加入300 μl预温的无血清培养基， 室温下静置15～30 min，使基质胶水化，再吸去剩余培养液。分别将2×105个细胞表面HSP70表达阳性的Colo+、CW2+和细胞表面HSP70表达阴性的Colo-、CW2-细胞悬浮在600 μl含10%血清的1640培养基中，接种在Transwell小室的下室中，置于培养箱培养48 h。将2×106个经HSP70-TKD诱导的NK细胞悬浮在1 ml的培养基，在Transwell小室上室中加入100 μl的NK细胞悬液，于5%CO2培养箱与下室的肿瘤细胞共同孵育，4 h后收集下室的细胞，加入PBS至100 μl，100 μl未加入小室的NK细胞和所收集100 μl下室的细胞加入1 μl CD56-PE和 CD94-FITC，室温暗处结合20 min后，PBS 洗涤2次，用100μl PBS 悬浮细胞，流式细胞仪检测CD56+CD94+的细胞数,NK细胞迁移率=下室CD56+CD94+细胞数/加样的CD56+CD94+细胞数[8，9]。

1.2.5NK细胞对细胞表面HSP70+和HSP70-的肿瘤细胞的杀伤以上述方法培养NK 细胞到10d时， 加入100 U/ml IL-2和2 μg/ml TKD，诱导4 d后的细胞为效应细胞，以Colo+、Colo-、CW2+、CW2-细胞为靶细胞(效靶比分别为5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)，同时设靶细胞组、效应细胞组和RPMI1640 空白对照组，37℃、5% CO2培养12 h。然后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，继续孵育4 h，每孔加DMSO 100 μl，吹打，混匀，用酶标仪检测570 nm 波长处光密度(A)值，计算其杀伤率。

2　结果

2.1NK细胞的扩增及表型分析从10例志愿献血者外周血单个核细胞中富集、扩增NK细胞，流式细胞仪检测CD3-CD56+NK细胞的纯度，结果表明，按照1.2.1的实验方法， NK细胞能明显扩增，NK细胞平均扩增950倍，扩增后CD3-CD56+NK细胞的百分比率最高值为(92.50 ±1.25)%,最低值为(78.36±0.82)%,取纯度的最高NK细胞作为以下各个实验用的细胞。结果见表1。

2.2HSP70-TKD诱导NK细胞表面CD94/NKG2C的表达当细胞培养至第10天时，加入100 U/ml IL-2 和2 μg/ml TKD，经HSP70-TKD诱导后，NK细胞细胞表面杀伤性受体CD94/NKG2C的表达量显著明显增加，较IL-2组和TKD组分别增加(223.45±7.56)%和(205.33±4.80)%，结果见图1。

2.3流式细胞分选HSP70阳性的肿瘤细胞人胰腺癌细胞Colo357和人结肠癌细胞CW2经流式分选后得到HSP70高表达的细胞株Colo+、CW2+和低表达的细胞株Colo-、CW2-，流式细胞仪回测各个细胞群的细胞表面HSP70的表达，结果见图2和图3，Colo+、Colo-细胞表面HSP70的表达分别为(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,差异有统计学意义(P<0.05);而CW2+、CW2-细胞表面HSP的表达分别为(91.1±2.5)%和(18.2±1.0)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　健康人外周血NK细胞的扩增倍数及细胞纯度Tab.1　Amplification times and percentage of NK cell from PBMC in blood donor

图1　HSP70-TKD诱导的NK细胞CD94/NKG2C的表达Fig.1　CD94/NKG2C expression levels on NK cells induced with HSP70-TKDNote: *.P<0.05 vs IL-2 group and TKD group.

图2　流式分选人胰腺癌细胞HSP70表达不同的细胞Fig.2　Cell line Colo357 was separated into Colo+ and Colo- with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05 vs Colo- group.

图3　流式分选人结肠癌细胞CW2细胞表面HSP0表达不同的细胞群Fig.3　Cell line CW2 was separated into CW2+ and CW2-with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs CW2- group.

图4　NK细胞向HSP70表达不同的胰腺癌细胞群迁移Fig.4　NK cell migrate to human pancreatic cell line with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs Colo- group.

图5　NK细胞向HSP70表达不同的结肠癌细胞群迁移Fig.5　NK Cell migrate to human colon carcinoma cell line with different HSP70 expressionNote: *.P<0.05，vs CW2-group.

表2　HSP70-TKD诱导的NK细胞对HSP表达不同的肿瘤细胞的杀伤(%)Tab.2　Cytolytic activity against tumor cells with different HSP70 expression by NK cells induced by HSP70-TKD(%)

2.4Transwell小室检测HSP70-TKD诱导的NK细胞对HSP70+和HSP70-细胞群的迁移能力Transwell小室实验结果见图4和图5，NK细胞对Colo+、Colo-的迁移率分别为(68.6±2.8)%、(22.8±1.5)%，差异有统计学意义(P<0.05)，对CW2+、CW2-的迁移率分别为(73.5±2.7)%、(18.2±1.3)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5HSP70-TKD诱导的NK细胞对胰腺癌细胞和结肠癌细胞的杀伤以诱导4 d后的NK细胞效应细胞，以Colo+、Colo-CW2+、CW2-细胞为靶细胞(效靶比分别为5∶1、10∶1、20：1、40∶1),结果见表2,结果表明，NK细胞在IL-2和TKD同时作用下，其对胰腺癌细胞Colo+的杀伤明显高于对Colo-的杀伤作用。结果见表2，当效靶比为10∶1其杀伤率已达到(50.5±2.5)%，明显高于Colo-组细胞的(22.5±1.2)%,当效靶比为40∶1时Colo+组杀伤率高达到(71.6±3.2)%，明显高于Colo-组细胞的(32.0±2.3)%， NK细胞对胰腺癌Colo+细胞和Colo-胞的杀伤率差异有统计学意义(P<0.01)。NK细胞对结肠癌细胞CW2+的杀伤明显高于对CW2-杀伤作用,当效靶比为40∶1时CW2+组杀伤率高达到(73.2±3.5)%，明显高于CW2-组细胞的(30.5±2.2)%， NK细胞对结肠癌CW2+细胞和CW2-细胞的杀伤率差异有统计学意义(P<0.01)。

3　讨论

自然杀伤细胞(NK细胞)是免疫系统中非常重要的一类细胞毒性淋巴细胞，是免疫系统中的第一道防线。NK细胞是一群特殊的细胞，它不同于获得性免疫在发挥功能的时候是需要抗体和主要组织相容性复合体(MHC)。在哺乳类动物受到病毒感染或者肿瘤侵袭的时候，NK细胞会非常迅速地产生反应。NK细胞表面表达多种抑制受体和活化受体，通过这两类受体的平衡来调控NK细胞的功能。正常情况下，抑制受体通过与自身MHCⅠ类分子结合抑制NK细胞的活性，产生自身耐受；当有异源刺激时，活化受体与配体结合，产生激活信号，并下调NK细胞表面抑制受体的表达，使NK细胞活化[10，11]。某些肿瘤细胞表面特异性表达HSP70，而肿瘤细胞表面的HSP70能够被NK 细胞表面活化型CD94 /NKG2C 受体所识别而诱导NK 细胞的杀伤活性。TKD 是HSP70 的表面抗原决定位， 与全长HSP70 一样能够激活NK 细胞杀伤细胞膜HSP70 表达阳性的肿瘤细胞[12]。NK细胞的迁徙不依赖于细胞与细胞之间的接触，在体外NK细胞的迁徙是由可溶性的细胞因子和趋化因子如TNF-α、 IL-2等诱导的。用TKD 和低剂量的IL-2直接诱导外周血单核细胞，诱导后NK细胞表面的杀伤性受体CD94/NKG2C表达显著增加。本项目的前期研究表明CD94+的NK细胞能明显抑制HSP70阳性的胰腺癌移植瘤且肿瘤组织有大量的NK细胞浸润，说明CD94+的NK细胞与HSP70和HSP70-TKD存在着相互作用。本研究Transwell小室实验表明肿瘤细胞分泌的可溶性因子HSP70相关的多肽(包括TKD)是NK细胞向HSP70阳性的肿瘤细胞迁徙的诱导因素，CD94+的NK细胞能识别HSP70阳性的肿瘤细胞并向它浸润。在NK细胞的胞浆里有很多溶细胞颗粒，当NK细胞活化时，会释放穿孔素(Perforin)和颗粒酶(Granzyme)等溶细胞蛋白，从而杀伤靶细胞。因此NK细胞在HSP70-TKD诱导下，其对细胞HSP70阳性肿瘤的杀伤活性明显增加。 在热疗和化疗的过程中必然会使肿瘤细胞表面的HSP70表达增加，其对HSP70-TKD 诱导NK 细胞的敏感性也随之增强。因此，肿瘤患者如果在化疗和热疗同时配合HSP70-TKD 诱导的NK细胞进行综合治疗可提高疗效。

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[收稿2015-10-26修回2016-04-07]

(编辑许四平)

·启事·

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《中国免疫学杂志》编辑部

Experimental study of HSP70-TKD induced NK cells migrated toward tumor cells

WANG Xiang-Ru，CHEN Rong-Ming，GONG Fu-Sheng，YING Min-Gang， ZHENG Qiu-Hong.Department of Tumor Molecular Biology，Fujian Tumor Research Institute，Fujian Provincial Cancer Hospital，Teaching Hospital of Fujian Medical Unniversity,the Key Laboratory of Biotherapy,Fuzhou 350014，China

Objective:To investigate the Migration ability toward human pancreatic carcinoma cell line and human colon carcinoma cell line with difference HSP70 plasma membrane expression.Methods: CD3-CD56+NK cells were obtained from human peripheral blood mononuclear(PBMC)in stem cell growth medium SCGM，2 μg/ml TKD was added to the medium on 10th day,the activating receptor CD94/NKG2C expression levels on NK cells was detected with FAC after 4 days.The human pancreatic carcinoma cell line Colo357 and the human colon carcinoma cell line CW2 were separated into Colo+and CW2+with high HSP70 expression and Colo-and CW2-with low HSP70 expression;Migration assays of NK to the four difference cell lines were performed in a Transwell cell culture system.The cytolytic activity of TKD-activated NK cells against the four subline with HSP70 expression on their cell surface was analyzed by MTT assay.Results: Flow cytometry analysis showed that CD3-CD56+NK cells could expanded after 2 weeks in SCGM medium,and the largest percentage of NK cell was (92.50 ±1.25)%.CD94 expression levels on NK cells increased obviously after TKD inducement the cell surface HSP70 expression of Colo+,Colo-were (78.2±2.2)% and (27.3±1.2)% separately,the cell surface HSP70 expression of CW2+，CW2-were (91.1±2.5)% and (18.2±1.0)% separately after FACS;the Migration of NK cells toward Colo+was (68.6±2.8)%,higher than the migration toward Colo-with (22.8±1.5)%;the Migration of NK cells toward CW2+was(73.5±2.7)%,higher than the migration toward CW2-with (18.2±1.3)%;the cytolytic activity of NK against Colo+was(61.2±3.0)% compared to (24.5 ±1.5)% against Colo-when the ratio of effector cells and target cell was 20∶1,the cytolytic activity of NK against CW2+was (63.8±3.2)% compared to (22.4±1.8)% against CW2-when the ratio of effector cells and target cell was 20∶1.Conclusion: TKD-activated NK cells are highly efficient cytolytic effector cells which have stronger significant migration toward HSP70-positive tumor target cells on their cell surface in vitro .

Tumor cells;HSP70-TKD;NK cells;Migration

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.008

R392.12文献标志码A

1000-484X(2016)08-1123-05

汪相如(1971年-)，男，主管技师，主要从事肿瘤免疫学的研究。

及指导教师：郑秋红(1962年-)，女，主任医师，主要从事肿瘤免疫治疗的研究，E-mail:zqh2858@foxmail.com。