潘智育,李 竟,陈云龙,王春苗,彭 政,粟正英,黎丹戎,侯华新
(1.广西医科大学药学院,广西 南宁 530021;2. 黑龙江省齐齐哈尔市第一医院,黑龙江 齐齐哈尔 161005;3. 广西医科大学附属肿瘤医院,广西 南宁 530021)
8-溴乙氧基大黄酸的合成及其对肝癌HepG2.2.15细胞乙肝病毒抑制作用的研究
潘智育1,李竟1,陈云龙2,王春苗1,彭政1,粟正英1,黎丹戎3,侯华新1
(1.广西医科大学药学院,广西 南宁530021;2. 黑龙江省齐齐哈尔市第一医院,黑龙江 齐齐哈尔161005;3. 广西医科大学附属肿瘤医院,广西 南宁530021)
doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.08.028
目的合成8-溴乙氧基大黄酸,探讨8-溴乙氧基大黄酸对肝癌HepG2.2.15细胞分泌的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的抑制作用和机制。方法以大黄酸为结构基础,化学全合成8-溴乙氧基大黄酸,采用红外光谱(IR)、核磁共振氢谱(1H-NMR)及碳谱(13C-NMR)对其结构进行表征;MTT法测定8-溴乙氧基大黄酸对细胞生长的抑制作用;ELISA检测HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg;Western blot法检测细胞内乙肝病毒X基因(HBx)蛋白的表达;流式细胞仪分析细胞周期;激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。结果IR、1H-NMR和13C-NMR的结果确证合成产物为8-溴乙氧基大黄酸,合成产物和大黄酸对HepG2.2.15细胞具有较好的抑制细胞生长的作用,作用72 h后IC50分别为14.29 mg·L-1和11.59 mg·L-1。采用无细胞毒剂量的8-溴乙氧基大黄酸处理细胞后,对细胞分泌的HBsAg和HBeAg有抑制作用,其抑制作用随着浓度的增加,呈现剂量依赖性,且合成产物的抑制效果优于大黄酸;8-溴乙氧基大黄酸可降低HBx蛋白表达水平和细胞内钙离子浓度,阻碍乙型肝炎病毒(HBV)复制,但不影响细胞周期。结论本研究合成的8-溴乙氧基大黄酸显示了比大黄酸更为优越的抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌作用的活性,其作用机制可能是通过降低HBx蛋白表达、减少钙离子浓度而实现。
8-溴乙氧基大黄酸;大黄酸;肝癌;乙型肝炎病毒;HBx;细胞内钙离子
原发性肝癌是一种发病率高、发现晚、恶化程度高的消化系统恶性肿瘤,严重威胁人类的生命和健康。近年的流行病学调查显示,我国肝癌死亡率在各种恶性肿瘤中居于第三位[1],而广西肝癌死亡率居恶性肿瘤之首位,且乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是诱导肝癌发生的重要病因[2]。因此,积极探究肝癌的发病机制、寻找有效抑制乙肝病毒感染的抗肝癌药物具有重要的现实意义。
蒽醌类化合物广泛存在于天然植物中,如大黄、何首乌、黄根等,随着对蒽醌类物质研究的深入,发现其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等重要的药理作用。如今临床上广泛应用的阿霉素、米托蒽醌等化疗药物就属于蒽醌类化合物。大黄酸是一种研究较多的蒽醌化合物,可通过阻滞细胞周期、增强半胱天冬氨酸蛋白酶活性等机制诱导肝癌细胞凋亡[3-4]。但其诱导细胞凋亡是否通过抑制乙肝病毒的复制、分泌作用尚不清楚,且大黄酸水溶性较差,与临床抗肿瘤药物相比存在特异性不高、功效低等问题,影响其生物活性的发挥。
为了进一步开发大黄酸及蒽醌化合物的药用价值,减少乙型肝炎病毒诱发肝癌的可能,改善肝癌高发生率、高死亡率的现状,寻找更理想的抗肝癌药物,本文以大黄酸为原料合成了溶解度好、毒性小、抗肿瘤活性强且抑制病毒能力高的8-溴乙氧基大黄酸,并探讨该合成产物对人肝癌HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响及其作用机制。
1.1材料
1.1.1药物与试剂大黄酸购自南京郎泽生物医药有限公司,含量大于98%;拉米夫定(3TC)为葛兰素史克制药(苏州)有限公司生产;二甲基亚砜、丙酮、1,2-二溴乙烷、乙酸乙酯、石油醚(分析纯,汕头西陇化工);噻唑蓝(MTT,北京Solarbio公司);MEM培养基(Hyclone);小牛血清(Gibco);胰酶(美国 Amersco 公司); Fluo-3/AM(美国Biotium公司);HBsAg和HBeAg ELISA 检测试剂盒(上海科华生物工程有限公司);周期检测试剂盒(Bender Med system);鼠抗HBx(Santa Cruz);兔抗GAPDH(Abcam);羊抗鼠lgG-HRP(Santa Cruz);Goat pAb to Rb lgG-HRP(Abcam);超敏ECL化学发光即用型底物(Boster Biological Technology)。
1.1.2仪器Set-laborata4000旋转蒸发仪(德国 Heidolph 公司);Axiovert 200荧光倒置相差显微镜(德国 Zeiss 公司);化学发光成像工作站(FlourChem M);Calibur流式细胞仪(美国BD公司);激光共聚焦显微镜 NikonA1(日本尼康出品);CO2培养箱(美国Thermo公司);Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo公司);1H-NMR 和13C-NMR采用500兆核磁共振仪(美国 Vrain 公司)测定;红外光谱由100FTIR光谱仪(美国 Perkin Elmer 公司)测定。
1.1.3细胞人肝癌HepG2.2.15细胞购自武汉大学保藏中心细胞库。细胞在37℃、5% CO2培养箱内以含10%小牛血清的MEM培养液在培养瓶内单层传代培养,取对数生长期细胞进行实验。
1.2方法
1.2.18-溴乙氧基大黄酸的合成在100 mL三口瓶中依次加入500.0 mg大黄酸(1.76 mmol),486.0 mg碳酸钾(3.52 mmol),35 mL DMF,混匀加热到60℃, 恒温搅拌30 min,缓慢滴加5.291 g(28.16 mmol)1,2-二溴乙烷,TLC点板检测跟踪反应进程,反应1.5 h后TLC点板,反应原料点消失。过滤除去碳酸钾。加入丙酮,使DMF与丙酮形成共沸物,80℃减压旋蒸除去大部分DMF,将浓缩的反应液倒入冰水中静止,析出沉淀,过滤,用冰水洗涤多次,将残留的DMF除去,得到粗品。采用硅胶柱层析,以石油醚 ∶乙酸乙酯(80 ∶1)为洗脱剂洗脱,除去溶剂,得到橙黄色固体,合成产物进行理化性质及结构鉴定。
1.2.2合成产物配制合成产物用DMSO溶解后配成10 g·L-1原液,0.2 μm有机系滤膜过滤除菌,避光保存。药物使用时,采用无血清培养基配制成所需的浓度,并使DMSO 终浓度小于2%。
1.2.3MTT法测定8-溴乙氧基大黄酸对细胞生长的抑制作用取对数生长期的HepG2.2.15细胞,以6.8×107·L-1密度接种于96孔板,每孔100 μL,培养24 h后,分别加入100 μL浓度为40、20、10、5、2.5、0 mg·L-1的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸,每个浓度设3个复孔。连续培养72 h,每孔加入MTT 20 μL,继续培养4 h后小心吸弃上清液,每孔加入DMSO 150 μL使结晶完全溶解。采用酶标仪在492 nm处检测吸光度值(OD值)。按下列公式计算细胞生长的抑制率和半数抑制浓度IC50值。生长抑制百率/%=[1-(药物组OD值/对照组OD值)]×100%,选择对细胞数量及形态几乎无影响的相应剂量作为后续研究的浓度。
1.2.4ELISA法定量检测细胞HBsAg和HBeAg分泌情况将2.5×107·L-1的细胞悬液加入24孔细胞培养板,每孔1 mL,置 CO2孵箱中培养24 h后除去全部培养液。分别加入对细胞数量及形态几乎无影响的IC15、IC10、IC53个终浓度的不同药物溶液,每个浓度设3个复孔。空白对照组加入等量的完全培养液,参照文献选择100 mg·L-1拉米夫定为阳性对照[5]。连续培养72 h后,分别吸出细胞上清液置于1.5 mL灭菌离心管中,-20℃保存,统一待检。采用ELISA试剂盒对上清HBsAg、HBeAg进行检测,操作按试剂盒的使用说明书进行,结果以抑制率表示。药物对抗原的抑制百分率(IR)/%=[1-(药物组OD值/对照组OD 值)]×100%。
1.2.5流式细胞仪测定细胞周期将HepG2.2.15细胞接种于6孔板中24 h后,加入药物浓度均为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸,以等量的完全培养液为空白对照,以拉米夫定为阳性对照药。处理72 h后,胰酶消化后用PBS漂洗,调整细胞浓度为6×108·L-1。75%乙醇固定过夜, 加入RNase A、300 μL碘化丙啶(PI),4℃避光下作用30 min。用流式细胞仪分析细胞周期的分布。
1.2.6Western blot法检测细胞内HBx蛋白8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸均以IC10的药物浓度处理HepG2.2.15细胞,以等量的完全培养液为空白对照,含100 mg·L-1拉米夫定的等量完全培养液为阳性对照。细胞经药物处理72 h后,提取蛋白,用 BCA 法检测蛋白含量后,以相同的蛋白量上样,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,转PVDF膜,5%脱脂奶粉封闭,鼠抗HBx(按1 ∶100稀释)一抗稀释液4℃孵育过夜,PBST洗涤3次,再用HRP标记的山羊抗鼠 IgG(按1 ∶1 000稀释)二抗稀释液常温孵育2 h,PBST 洗涤3次,超敏ECL化学发光即用型底物反应后,用化学发光成像仪扫描结果。
1.2.7激光共聚焦检测细胞内游离钙离子浓度取对数生长期细胞,调整细胞浓度为1×108·L-1,接种于激光共聚焦显微镜专用培养皿中,每皿2 mL细胞悬液。培养24 h后,弃去原培养液,加入药物浓度为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸,以等量的完全培养液为空白对照,以拉米夫定为阳性对照药。处理72 h后用 HEPES缓冲液洗3遍,每皿加入8 μmol·L-1的 Fluo-3/AM荧光染料,37℃避光负载50 min,HEPES缓冲液洗3遍,于激光扫描共聚焦显微镜下,选择激发波长488 nm,发射波长530 nm,激光强度9.0,光电倍增管电压110 v条件下摄图。记录并分析荧光强度。
2.18-溴乙氧基大黄酸的结构鉴定合成产物为橙黄色粉末,mp:156℃~158℃,纯度为98.0%。IR、1H-NMR和13C-NMR数据见Tab 1。
2.28-溴乙氧基大黄酸对细胞生长的抑制作用从Tab 2可知,随着8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸浓度的增高,HepG2.2.15细胞抑制率相应增高,呈浓度依赖性。8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸对HepG2.2.15作用72 h的IC50分别为14.29 mg·L-1和11.59 mg·L-1。结合细胞形态学观察,当8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸的抑制率小于15%时,HepG2.2.15细胞无论在形态上还是数量上与空白对照相同。因此,选择8-溴乙氧基大黄酸IC15(6.76 mg·L-1)、IC10(5.02 mg·L-1)、IC5(3.16 mg·L-1)和大黄酸IC15(6.03 mg·L-1)、IC10(4.89 mg·L-1)、IC5(2.88 mg·L-1)作为后续研究浓度。
2.38-溴乙氧基大黄酸对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响经无细胞毒浓度IC15、IC10、IC5作用72 h后,8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg 有明显的抑制作用,除了IC5浓度外,其他各组浓度对病毒抑制作用与阳性药物拉米夫定相似。且抑制作用随着浓度的增加,几乎呈现剂量依赖性。同时在相同抑制率浓度下,8-溴乙氧基大黄酸对病毒HBsAg的抑制效果优于大黄酸(Tab 3)。
2.4流式细胞仪测定细胞周期与空白对照组相比,经药物浓度为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸作用72 h后,细胞G1、G2和S期分布差异均无显著性(P>0.05) ;而阳性对照组拉米夫定与空白对照组相比,G1、G2和S期差异均存在显著性(P<0.01)。见Fig 1。
2.5Western blot法检测8-溴乙氧基大黄酸对细胞内HBx蛋白表达的影响如Fig 2所示,人肝癌细胞HepG2.2.15细胞中HBx蛋白表达较高,与空白对照组比较,拉米夫定和8-溴乙氧基大黄酸均能够明显降低HBx蛋白的表达(P<0.05),而未经结构修饰的大黄酸并不能降低HBx蛋白的表达。提示大黄酸经结构修饰后的8-溴乙氧基大黄酸具有更强的抑制肝癌病毒作用。
2.6激光共聚焦检测细胞内游离钙离子浓度细胞内钙离子与Fluo-3/Am荧光染料结合后显绿色荧光, 其荧光强度与细胞内钙离子的浓度成正相关。研究发现,HBx可激活钙离子刺激的转录因子,其在宿主细胞中调节HBV DNA复制与释放线粒体内钙引起的胞质钙离子浓度升高密切相关。
从Tab 4结果可见,在正常情况下,HepG2.2.15细胞内有钙离子存在,经药物浓度为IC10的8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸处理24 h后,大黄酸对钙离子浓度影响不大;而8-溴乙氧基大黄酸使钙离子浓度下降,与空白组比较,差异存在显著性(P<0.05)。结果证明,8-溴乙氧基大黄酸与阳性对照拉米夫定作用相似,可降低HepG2.2.15细胞内钙离子浓度。
乙型肝炎病毒感染是我国肝癌发生的最主要原因,抗HBV在治疗肝癌中具有举足轻重的作用。目前,公认的抗HBV治疗药物主要有α干扰素和核苷类似物[6]。大多数核苷类药物可抑制HBV DNA聚合酶活性进而抑制病毒,从而达到抗HBV疗效;而α干扰素通过抑制HBV的复制和免疫调节机制,调节机体对HBV的免疫应答,二者协同抗病毒[7-8]。但干扰素不良反应较大,核苷类似物存在病毒耐药问题,大多数患者在长期治疗后仍不能彻底清除病毒。因此,开发筛选新型低毒的抑制乙肝病毒复制抗肝癌药物,并探明其作用机制是目前研究的热点和难点。
Tab 1 IR,1H-NMR and 13C-NMR spectrum of synthetic
Tab 2The inhibitory effect of 8-bromo-ethoxy
Drugconcentration/mg·L-1Inhibitoryrate/%8-bromo-ethoxyRheinRhein 4098.83±0.2595.81±1.61 2054.47±2.1580.87±2.09 1026.30±2.2231.55±2.90 58.67±1.7712.19±2.91 2.52.15±1.412.24±0.68IC50/mg·L-114.29±0.6711.59±1.34
Fig 1 Effect of 8-bromo-ethoxy Rhein on cell cycles in HepG2.2.15 cells
**P<0.01vscontrol
Fig 2 Effect of 8-bromo-ethoxy Rhein
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
大黄酸等蒽醌类化合物具有抗病毒、保肝抗纤维化、抗肝癌等药理活性,且药理作用已被医学界广泛认可。蒽醌类化合物呈平面型的多芳香环结构[9], 这种结构可以嵌入到DNA 相邻的碱基对之间, 以嵌入的形式与 DNA双螺旋形成可逆的结合, 使DNA降解,并抑制 DNA拓扑异构酶II, 使DNA与拓扑异构酶II形成的复合物僵化,影响DNA的转录、合成,从而达到抗肿瘤的作用[10-13]。但是蒽醌环结构对DNA的嵌入作用是可逆的,通过侧链结构的修饰可以提高蒽醌类药物对DNA的嵌入作用, 提高蒽醌类药物与肝癌细胞的亲合力。为了增加蒽醌环对肝癌细胞的亲合力,得到溶解性好、毒性小、抗肿瘤活性强且抑制病毒能力高的抗肝癌药物,本研究在大黄酸的基础上对侧链进行修饰,合成了8-溴乙氧基大黄酸。结果表明,8-溴乙氧基大黄酸和大黄酸均可抑制人肝癌细胞HepG2.2.15的HBsAg 、HBeAg病毒的分泌,且8-溴乙氧基大黄酸的抑制病毒作用优于大黄酸。推测改变大黄酸的侧链结构可以抑制蒽醌环结构对DNA的嵌入作用的可逆性,促进病毒DNA的降解。
HBV基因组含有 S 、C 、P 、X 4个开放读码框,其中X基因编码HBx蛋白。HBx具有广泛的反式激活功能,激活同源或异源基因的启动子,促进病毒复制和正常肝细胞感染,对肝癌的发生、发展至关重要。实验研究发现,将HBx导入小鼠的肝细胞中,可引起肝细胞的恶性转化。将HBx基因转入小鼠体内,可诱发转基因小鼠肝癌形成,缺失X基因的乙型肝炎病毒不能有效地进行感染[14,15]。HBx表达越高,其感染能力就越强,通过抑制或减少HBx表达则可降低HBV感染能力,有利于肝癌的治疗。此外,HBx涉及钙信号途径的介导,能够上调细胞内钙离子浓度来保持HBV复制能力[16]。如Bouchard等[17]指出,HBx蛋白对病毒复制的影响与细胞内钙信号传导通路有关,通过影响细胞内钙离子浓度,激活Pyk2,进而通过Src影响HBV病毒的复制。故推测,减少细胞内钙离子浓度可间接减少HBx的促HBV激活能力,同时可减少肝癌细胞转化的机会。
DruganddoseHBsAginhibitoryrate/%IC15IC10IC5HBeAginhibitoryrate/%IC15IC10IC58-bromo-ethoxyRhein43.70±1.29*44.09±0.69*30.71±1.28**29.45±2.8224.96±2.3621.93±1.16*Rhein32.68±3.4825.59±1.5812.20±0.9130.03±2.1234.74±4.8813.17±1.553TC/100mg·L-127.17±3.0114.86±0.79
*P<0.05,**P<0.01 under the concentration at the same inhibitory rate, 8-bromo-ethoxy Rhein was compared with Rhein
Tab 4 Results of intracellular free calcium concentration in each ±s,n=3)
*P<0.05,**P<0.01vscontrol
HepG2.2.15细胞系是肝癌细胞HepG2稳定转染4个全长HBV基因组而建立的,能够稳定分泌HBsAg、HBeAg及Dane颗粒,可检测到细胞内各种中间复制体,为研究HBV复制和调控的分子机制提供了一个有效的体外实验模型[18-19]。本研究利用HepG2.2.15细胞模型证实,8-溴乙氧基大黄酸可明显降低线粒体钙离子通道中钙离子浓度(P<0.01),与Western blot法结果中HBx蛋白的表达降低(P<0.05)相辅相成, 共同说明8-溴乙氧基大黄酸可调节HepG2.2.15细胞内HBV DNA,降低HBx蛋白的表达,从而减弱HBV病毒的感染能力,最终提高抑制HBV病毒的抗肿瘤作用。此外,研究中还发现,经无细胞毒剂量8-溴乙氧基大黄酸、大黄酸作用HepG2.2.15细胞后,细胞周期各时相的分布与空白对照组比较无差异,其抑制HepG2.2.15细胞分泌病毒的作用机制与拉米夫定存在部分差异,8-溴乙氧基大黄酸有效发挥作用的分子机制仍有待进一步研究。
综上所述, 8-溴乙氧基大黄酸具有调控细胞HBx蛋白的表达,影响细胞线粒体膜内钙离子浓度变化,抑制细胞HBV病毒的复制、肝癌细胞的生长和分泌乙肝病毒的能力等活性,说明对具有蒽醌母环结构的化合物进行结构修饰,有可能获得有应用前景的新型低毒抗肝癌药物,为肝癌的临床辅助治疗研究提供了重要依据。
(致谢:本文实验在广西医科大学医学科学实验中心完成,特此致谢。)
[1]陈万青, 张思维, 曾红梅, 等. 中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J]. 中国肿瘤, 2014, 23(1): 1-10.
[1]Chen W Q, Zhang S W, Zeng H M, et al. Report of cancer incidence and mortality in China,2010[J].ChinaCancer, 2014,23(1): 1-10.
[2]赫晓林, 黄建炜, 许瑞安, 崔秀灵. HBV病毒复制机制及慢性乙型肝炎药物靶点[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(3): 152-6.
[2]He X L, Huang J W, Xu R A,Cui X L. Hepatitis B virus replication mechanisms and drug targets of chronic hepatitis B[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(3): 152-6..
[3]Lai W W, Yang J S, Lai K C,et al. Rhein induced apoptosis through the endoplasmic reticulum stress, caspase-and mitochondria-dependent pathways in SCC-4 human tongue squamous cancer cells[J].InVivo, 2009, 23(2): 309-16.
[4]Shi P, Huang Z, Chen G. Rhein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells[J].AmJChinMed, 2008, 36(4): 805-13.
[5]李丽, 李勇文, 唐爱存. 甲基阿魏酸对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用[J]. 中药药理与临床, 2011,27(3):14-6.
[5]Li L, Li Y W,Tang A C. The inhibitory effect of methferulic acid on HBsAg and HBeAg in the HepG2.2.15 cells[J].PharmacolClinMed, 2011,27(3):14-6.
[6]卫生部. 原发性肝癌诊疗规范(2011年版)[J]. 临床肿瘤学杂志, 2011, 16(10): 929-46.
[6]Ministry of Public Health. Treatment protocols of primary liver cancer(2011 edition)[J].ChinClinOncol, 2011,16(10): 929-46.
[7]Zhang Y H, Wu Y Q, Ye S Q,et al. The response to interferon is influenced by hepatitis B virus genotypeinvitroandinvivo[J].VirusRes, 2013, 171(1): 65-70.
[8]杨凯, 管世鹤, 王爱华, 等. 拉米夫定联合α干扰素序贯处理增强干扰素诱导跨膜蛋白表达的研究[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(11): 1568-72.
[8]Yang K, Guan S H, Wang A H, et al. Enhancement of interferon-induced transmembrane protein expression in HepG2.2.5 cells sequentially treated with lamivudine and interferon-α[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(11): 1568-72.
[9]陆豫, 黄志纾, 谭嘉恒,等. 大黄素衍生物的合成及细胞毒性研究[J]. 有机化学, 2005, 25(8): 944-8.
[9]Lu Y, Huang Z S, Tan J H,et al. Synthesis and cytotoxicity of emodin derivatives[J].ChinJOrgChem, 2005, 25(8): 944-8.
[10]Capranico G, Palumbo M, Tinelli S, et al. Conformational drug determinants of the sequence specificity of drug-stimulated topoisomerase II DNA cleavage[J].JMolBiol, 1994, 235(4): 1218-30.
[11]Glisson B S, Killary A M, Merta P,et al. Dissociation of cytotoxicity and DNA cleavage activity induced by topoisomerase Ⅱ-reactive intercalating agents in hamster-human somatic cell hybrids[J].CancerChemotherPharmacol, 1992, 31(2): 131-8.
[12]Zunino F, Capranico G. DNA topoisomerase II as the primary target of anti-tumor anthracyclines[J].AnticancerDrugDes, 1990, 5(4): 307-17.
[13]Ben D D, Palumbo M, Zagotto G,et al. DNA topoisomerase II structures and anthracycline activity: insights into ternary complex formation[J].CurrPharmDes, 2007, 13(27): 2766-80.
[14]Kim C M, Koike K, Saito I, et al. HBx gene of hepatitis B virus induces liver cancer in transgenic mice[J].Nature, 1991, 351(6324): 317-20.
[15]Yu D Y, Moon H B, Son J K, et al. Incidence of hepatocellular carcinoma in transgenic mice expressing the hepatitis B virus X-protein[J].JHepatol, 1999, 31(1): 123-32.
[16]Yang N, Tang Y, Wang F,et al. Blockade of store-operated Ca2+entry inhibits hepatocarcinoma cell migration and invasion by regulating focal adhesion turnover[J].CancerLett, 2013, 330(2): 163-9.
[17]Bouchard M J, Wang L H, Schneider R J. Calcium signaling by HBx protein in hepatitis B virus DNA replication[J].Science, 2001, 294(5550): 2376-8.
[18]Sells M A, Chen M L, Acs G. Production of hepatitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J].ProcNatAcadSci, 1987, 84(4): 1005-9.
[19]Sells M A, Zelent A Z, Shvartsman M,et al. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions[J].JVirol, 1988, 62(8): 2836-44.
Synthesis of 8-bromo-ethoxy Rhein and evaluation of its inhibition effect on hepatitis B virus in human hepatoma cells HepG2.2.15
PAN Zhi-yu1, LI Jing1, CHEN Yun-long2,WANG Chun-miao1, PENG Zheng1, SU Zheng-ying1, LI Dan-rong3, HOU Hua-xin1
(1.CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.TsitsiharFirstHospitalofHeilongjiangProvince,TsitsiharHeilongjiang161005,China;3.AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)
AimTo synthesize 8-bromo-ethoxy Rhein and investigate its mechanisms and inhibition effect on hepatitis B surface antigen(HBsAg) and e antigen(HBeAg)in HepG2.2.15 cells.Methods8-bromo-ethoxy Rhein was synthesized based on the chemical structure of Rhein,and its structure was identified by IR,1H-NMR and13C-NMR spectra.MTT assay was used to test the inhibitory effect of 8-bromo-ethoxy Rhein on HepG2.2.15 cells. After the cells treatment by 8-bromo-ethoxy Rhein, the HBsAg and HBeAg in cell supernatant were detected by ELISA. The expression of hepatitis B virus X gene(HBx) was detected by Western blot. The cell cycles were examined with flow cytometry. The intracellular free calcium concentration was detected by laser scanning confocal microscopy.ResultsThe structure of 8-bromo-ethoxy Rhein was confirmed by IR,1H-NMR and13C-NMR.MTT results showed that synthetic product and Rhein could inhibit the cell proliferation in HepG2.2.15 cells. After treated with 8-bromo-ethoxy Rhein and Rhein for 72 h,the half inhibitory concentration 50%(IC50) was 14.29 mg·L-1and 11.59 mg·L-1, respectively. Using non-cytotoxic dose of 8-bromo-ethoxy Rhein, the inhibitory effect on HBsAg and HBeAg was gradually enhanced with increasing 8-bromo-ethoxy Rhein concentration.The inhibitory effect of synthetic product on hepatitis B virus was better than that of Rhein. 8-bromo-ethoxy Rhein could down-regulate the expression of HBx,intracellular calcium ion concentration and block the hepatitis B virus(HBV) replication. Flow cytometry results showed 8-bromo-ethoxy Rhein didn′t affect the cell cycle.ConclusionsCompare with Rhein, the synthesis of 8-bromo-ethoxy Rhein shows stronger inhibition on hepatitis B virus in HepG2.2.15, and its mechanisms may involve down-regulating the expression of HBx and reducing calcium ion concentration.
8-bromo-ethoxy Rhein;Rhein;human hepatoma cells; hepatitis B virus; HBx; intracellular calcium
2016-04-20,
2016-05-15
国家自然科学基金资助项目(No 81460561); 广西高校重点实验室-壮医方药基础与应用研究重点实验室(No 桂教科研〔2014〕6号)
潘智育(1991-),女,硕士生,研究方向:分子药理学,E-mail: panzhiyu123123@163.com;
侯华新(1960-),男,教授,硕士生导师,研究方向:分子药理学与药物化学,通讯作者,E-mail:houhuaxin@163.com
A
1001-1978(2016)08-1175-06
R284.1;R392.11;R373.21;R735.7;R977.6
网络出版时间:2016-7-19 10:43网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160719.1043.056.html