60min/d游泳运动对大鼠脑衰老和海马GAP-43表达的影响

蔡婧 袁琼嘉

60min/d游泳运动对大鼠脑衰老和海马GAP-43表达的影响

蔡婧 袁琼嘉

目的：探讨60min/d游泳运动对D-半乳糖致大鼠脑衰老和海马GAP-43表达的影响。方法：将42只SD大鼠随机分为：0.9%Nacl对照组（Na），衰老组（D），运动干预组（Ds），n=14。测定大脑皮质GSH-Px、SOD活性和MDA含量，Western blotting检测海马GAP-43蛋白表达。结果：D组较Na组行动迟缓，精神不振且嗜睡，皮毛无光泽、卷曲枯黄且伴有严重脱落等衰老体症明显；D组与Na组相比GSH-PX、SOD活性非常显著性降低（P＜0.01），MDA含量非常显著升高（P＜0.01）；Ds组GSHPX活性显著性高于D组（P＜0.05），SOD活性非常显著性高于D组（P＜0.01），MDA含量非常显著性低于D组（P＜0.01）；Ds组和Na组GSH-PX、SOD活性和MDA含量均无显著性差异（P＞0.05）。D组海马GAP-43蛋白表达量非常显著性低于Na组（P＜0.01）；Ds组海马GAP-43蛋白表达量非常显著性高于D组（P＜0.01）；Ds组海马GAP-43蛋白表达量显著性低于较Na组（P＜0.05）。结论：（1）注射D-半乳糖（100mg/kg/d）6周，可以建立大鼠脑衰老模型。（2）在大鼠衰老过程中进行60min/d游泳运动干预可以延缓脑衰老，减缓海马GAP-43蛋白表达量的下调。

有氧运动；衰老；海马；GAP-43；大鼠

10.16730/j.cnki.61-1019/g8.2016.08.092

学习记忆能力会随着脑的衰老而逐渐减退［1］。自由基学说是目前公认的衰老学说之一［2］。有氧运动能提高机体清除自由基的能力，延缓衰老［3］。海马与空间学习和记忆密切相关［4］。GAP-43不仅对神经纤维的生长、发育和轴突的再生以及突触功能的维持等方面起着重要的作用，而且还参与调节神经递质的释放［5］。本实验运用D-半乳糖致大鼠脑衰老［6］。在大鼠脑衰老过程中经行60min/d游泳运动干预，观察60min/d游泳运动对大鼠脑衰老和海马GAP-43表达的影响，从分子水平探讨60min/d游泳运动对脑衰老的影响机制。

1.材料与方法

1.1造模和取材

42只4月龄SPF级雄性SD大鼠，体重400±20g，购于成都达硕生物科技有限公司，生产许可证CSXK（川）2008-24。

自由饮食，光照，适应性喂养1周后，随机分为：0.9%Nacl对照组（Na），衰老组（D），运动干预组（Ds）（见表1）。

表1　分组造模

Na组每日9：00注射0.9%Nacl（2ml/kg/d），共6周；D组和Ds组每日注射5%D-半乳糖，注射时间和计量同Na组；Ds组每日注射5%D-半乳糖的同时，19：00进行60mim/d的游泳运动训练（水深80cm，水温34±2℃），每周训练6天。6周后，断头取脑，剥离海马和大脑皮质用冻存管分装入液氮罐保存。

1.2自由基指标检测

考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒检测大脑皮质蛋白总量；微量还原型谷胱甘肽测定试剂盒和超氧化物歧化酶（SOD）WST -1法测定试剂盒检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物岐化酶（SOD）活性；丙二醛（MDA）测定试剂盒检测丙二醛（MDA）含量。具体实验操作步骤严格按照说明书进行。

1.3western blot检测

海马组织按1mg：20 μl裂解液比例匀浆提取样品基因总蛋白；总蛋白浓度用碧云天BCA蛋白浓度测试试剂盒测定；蛋白变性；蛋白样品SDS-PAGE凝胶电泳至分离，转印PVDF膜，8%脱脂奶粉室温封闭1h，一抗（ab9018），浓度：1：1000，4℃孵育过夜；二抗（山羊抗小鼠lgG/辣根酶标记），浓度：1：2000，37℃孵育2h；暗室显影、定影。Quantity One分析软件，条带轨迹定量分析法（TraceTracking）分析条带灰度值，与βactin扫描值相比，以其比值作为目的蛋白的表达量［7］

1.4统计学分析

SPSS17.0分析得出结果以均值±标准差表示，单因素方差分析组间比较，P＜0.05表示具有显著性意义，P＜0.01表示具有非常显著性意义。

2.结果

2.1大鼠状态观察

表3　各组大鼠大脑皮质GSH-Px、SOD活性和MDA含量（X±S，n=6）

D组大鼠行动迟缓，精神不振且嗜睡，皮毛无光泽、卷曲枯黄且伴有严重脱落。Na组与D组相比，精神状态良好且行动敏捷、毛发富有光泽。

2.2自由基检测结果

2.3海马GAP-43 western-blotting检测结果

图1　各组GAP-43基因蛋白表达量

3.讨论

3.1大鼠脑衰老模型验证

GSH-PX、SOD等协同可以将大部分O-2反应掉，是体内清楚自由基的主要酶类［8］。但是随着年龄的递增，不断的衰老，GSH-PX、SOD的合成会逐步减少；活性也会降低，导致过氧化物在体内大量的堆积，使体内脂质过氧化产物MDA水平升高［9］。本实验采用动物腹腔注射D-半乳糖致衰老［1 0］，发现D组大鼠行动迟缓，精神不振且嗜睡，皮毛无光泽、卷曲枯黄且伴有严重脱落等衰老体症。Na组大鼠精神状态良好且行动敏捷、毛发富有光泽。一般状态观察发现，D组表现出明显的衰老症状。通过自由基检测，D组大鼠大脑皮质GSHPX和SOD活性显著性低于Na组（P＜0.01）；MDA含量显著性高于N组（P＜0.01）。研究结果证明本次连续6周腹腔注射D-半乳糖造脑衰老模型成功。

3.2有氧运动对大鼠脑GSH-PX、SOD活性和MDA含量的影响

运动训练一方面能够有效地提高机体清除自由基的能力，另一方面又会致机体生成自由基［1 1］。本次实验运用60min/d无负重游泳运动的手段干预D-半乳糖致衰老过程，检测大鼠脑GSH-PX、SOD活性和 MDA含量。结果显示：Ds组与D组相比较GSH-PX活性显著性提高（P＜0.05）；SOD活性非常显著性提高（P＜0.01），而Ds组MDA含量非常显著性的低于D组（P＜0.01）。Ds组在衰老的过程进行了60min/ d游泳运动干预有效地增强了大脑GSH-PX、SOD的活性，同时脂质过氧化产物MDA的含量也被降低了。与6周跑台训练可以提高大脑皮层和海马的GSH-PX、SOD的活性，降低MDA、LPO的含量［1 2］。以及适度的有氧运动可以提高大脑的抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应［1 3、1 4、1 5］，等结论一致。

3.3有氧运动对大鼠海马GAP-43表达的影响

GAP-43是神经系统发育和轴突再生的关键［16］，学习记忆的神经基础是突触可塑性，其典型的表现是LTP的形成，GAP-43在此过程中起着重要的作用。本研究结果显示：D组与Na组相比较海马GAP-43蛋白表达水平非常显著性降低（P＜0.01），说明大脑衰老后，海马GAP-43蛋白的表达水平显著下降。Ds组与D组相比海马GAP-43蛋白表达水平非常显著性上调（P＜0.01），Ds组与Na相比海马GAP-43蛋白表达水平显著性下降（P＜0.05）。提示衰老过程中经行60min/d游泳运动即有氧运动干预可以有效地控制海马GAP -43蛋白表达水平的下降，是降低大鼠衰老过程中学习记忆能力衰退的机制之一。

4.结论

4.1注射D-半乳糖（100mg/kg/d）6周，可以成功建立大鼠脑衰老模型。

4.2大鼠衰老过程中进行60min/d游泳运动干预可以延缓脑衰老，减缓海马GAP-43基因mRNA和蛋白表达量的下调。可能是延缓大鼠衰老过程中学习记忆能力衰退的机制之一。

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国家自然科学基金（项目编号：31371202）；四川省科技厅科技支撑计划项目（项目编号：2012SZ0067）；国家体育总局、四川省运动医学重点实验室＂四川省高校科研创新团队专项基金研究成果＂。

蔡 婧（1985-），女，江西大余人，硕士研究生，研究方向：运动与健康促进，运动人体科学，私立华联学院；袁琼嘉（1956-），女，重庆市人，研究方向：体育运动与健康促进、运动人体科学，教授，成都体育学院运动医学系。（通讯作者）