生长抑素联合大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠的作用

冯 辉， 吴 标， 赵习德， 郭宝瑞

(新乡医学院第一附属医院中西医结合科，河南新乡453100)

生长抑素联合大柴胡汤对重症急性胰腺炎大鼠的作用

冯 辉△， 吴 标， 赵习德， 郭宝瑞

(新乡医学院第一附属医院中西医结合科，河南新乡453100)

目的:建立重症急性胰腺炎大鼠模型，研究生长抑素(奥曲肽)联合大柴胡汤对急性重症胰腺炎的作用及初步机制。方法:50只大鼠随机分为假手术组、模型组、奥曲肽组、大柴胡汤组与联合组，经相应处理后记录腹水量，测定血清中淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和肌酐(creatinine，Cr)的水平，HE染色后观察胰腺组织形态，Western blot检测胰腺细胞核中NF-κB与细胞中IκBα的蛋白表达水平，qPCR检测胰腺细胞中ICAM-1与IL-1的mRNA表达水平。结果:生长抑素联合大柴胡汤能有效降低重症急性胰腺炎大鼠的腹水量以及血清中AMY、ALT和Cr的水平;重症急性胰腺炎可导致胰腺细胞核NF-κB蛋白表达升高，IκBα蛋白表达降低，ICAM-1和IL-1 mRNA表达升高。生长抑素联合大柴胡汤可逆转这些改变。结论:生长抑素联合大柴胡汤可以减轻大鼠的急性重症胰腺炎，其机制可能与抑制NF-κB信号通路以及ICAM-1和IL-1表达有关。

急性重症胰腺炎;奥曲肽;大柴胡汤;NF-κB;ICAM-1;IL-1

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是外科常见的急腹症之一，依据胰腺坏死的情况、并发症的严重程度以及脏器的损坏情况分为轻型、重症轻型与重症3种类型，后2种统称为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，约占急性胰腺炎患者的30%。由于重症急性胰腺炎的发病机制尚未明确，因此缺乏有效的药物与治疗手段。由于并发症多，病死率高，可引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)［1－3］。生长抑素是一种广泛分布与脑、胃肠道、内外分泌腺等部位的多肽，具有抑制胰腺胰液和胰酶分泌，对胰腺细胞具有保护作用。奥曲肽(octreotide，Oct)是人工合成的长效生长抑素八肽药物，已有研究表明生长抑素能够抑制重症胰腺炎大鼠胰酶的释放［4］。此外有学者发现，大柴胡汤(Dachaihu decoction，DCHD)能够预防重症胰腺炎合并腹腔间隔室综合征，疗效显著［5］。大柴胡汤由柴胡、黄岑、半夏、芍药、枳实、大黄、生姜和大枣8味中药组成。研究显示，大柴胡汤能够有效改善急性水肿性胰腺炎，并能降低血清淀粉酶(amylase，AMY)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基转移酶的水平，有助于血液流向肝脏和胰腺，具有显著的抗炎作用［6］。目前临床还没有采用生长抑素联合大柴胡汤治疗急性重症胰腺炎的研究，因此，我们探讨生长抑素联合大柴胡汤对急性重症胰腺炎大鼠的作用及其相关的初步机制。

材料和方法

1 实验动物

实验选用SPF级Wistar大鼠50只，雄性，体重(230±20)g，由湖北省疾病预防控制中心动物实验中心提供，正常饮食饲养，室温(22±2)℃，湿度(60 ±5)%，每天照明12 h。

2 实验药物与试剂

大柴胡汤主方为柴胡15 g，黄岑9 g，半夏9 g，芍药9 g，枳实9 g，大黄6 g，生姜15 g，大枣5个，由广州中医药大学附属第一医院中药房煎制。大鼠的给药剂量计算公式为dB=dA×RB/RA×(WA×WB) 1/3，dA和dB分别为人与大鼠的体重系数(mg/kg)，RA和RB分别为人和大鼠的体型系数(RA=10，RB =59)，WA和WB分别为人和大鼠的体重(kg)，大鼠的给药量相当于含生药8.2 g·kg－1·d－1［7］;牛磺胆酸钠购自Sigma;奥曲肽购自Sandoz;NF-κB和IκBα抗体购自北京博奥森有限公司。

3 方法

3.1 重症急性胰腺炎大鼠模型的制备 造模前禁食12 h，饮水不限制。称重后，采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后固定在手术台上，腹部剪毛消毒，于剑突下切开，显露十二指肠与胰胆管，采用无损伤血管夹双重夹闭胰胆管远端胆管近肝门处，用0.45 mm头皮针经十二指肠外壁穿入肠腔，经十二指肠乳头滑行穿入胰胆管末端，用无损伤血管夹固定针头。用微量泵恒速(0.1 mL/mim)向主胰管内推注新鲜配置的5%牛黄胆酸钠溶液(1 mL/kg)，注射完成后，抽出头皮针，但仍保留无损伤血管夹继续夹闭5 min，使牛磺胆酸钠溶液充分进入各胰腺小叶，5 min后取下血管夹，复位十二指肠，关腹缝合。假手术组的操作与上述基本相同，但把注入胰胆管内液体改为生理盐水。

3.2 大鼠分组与给药处理 将SPF级雄性大鼠随机分为5组(n=10):假手术(sham)组、SAP组、Oct组、DCHD组和联合治疗(combined treatment，COM)组。Oct组大鼠造模成功后，给予股静脉注入奥曲肽10 μg/kg;DCHT组大鼠造模成功后0 h、2 h、4 h时分别灌胃大柴胡汤;COM组同时采用上述2组的处理方法;SAP组给予等量的生理盐水1 mL/kg。

3.3 腹水量的测定 将干棉球称重，用干棉球吸附各组大鼠腹水后称重，并计算腹水量，计算公式:腹水量=湿棉球重量－干棉球重量。

3.4 血清指标的测定 造模后12 h，用注射器进行心脏穿刺抽血约3 mL，4 000 r/min离心20 min，取上层血清，采用全自动生化检测仪测量各组大鼠血清AMY、ALT和肌酐(creatinine，Cr)的水平。

3.5 HE染色 造模12 h后，剪去各组大鼠胰腺组织，用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片。二甲苯脱蜡，依次用无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇浸泡5 min，苏木素染色15 min，蒸馏水冲洗，伊红染色3 min，依次泡入70%、85%、95%的乙醇至无水乙醇各1 min，二甲苯透明，中性树胶封片。

3.6 免疫印迹法 取各组大鼠胰腺组织，其中一部分组织使用胞浆胞核蛋白提取试剂盒提取细胞核中蛋白，另一部分组织离心，提取细胞总蛋白。定量并调整蛋白量。取等量裂解产物，进行 12%SDSPAGE。电转至硝酸纤维素膜上，加入脱脂牛奶，室温封闭2 h，加入I抗孵育过夜，TBST洗涤2次;再加入相对应II抗，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，化学发光法显色凝胶成像系统扫描灰度值进行分析。

3.7 qPCR 取各组大鼠胰腺组织，按照TRIzol说明书提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR仪进行扩增，所用引物序列:ICAM-1的上游引物序列为5’-GCCTGGGGTTGGAGACTAAC-3’，下游引物序列为5’-CTGTCTTCCCCAATGTCGCT-3’;IL-1的上游引物序列为5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’，下游引物序列为5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’。扩增条件为93℃ 35 s，65℃ 40 s，72℃ 50 s，共34个循环;74℃3 min。所得结果直接在荧光定量操作系统中进行比较分析，目标基因的相对定量用2－ΔΔCt公式计算。

4 统计学处理

数据采用SPSS 15.0统计软件进行分析，所有实验结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间差异应用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组均数间两两比较采用Bonferroni校正的t检验;以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 各组大鼠腹水量测定

Sham组大鼠只有少量无色透明的腹水;SAP组大鼠有大量红褐色的腹水，显著多于sham组(P＜0.05);与sham组相比，Oct组和DCHD组大鼠的腹水量明显减少(P＜0.05)，呈红褐色，而COM组大鼠腹水量更显著减少(P＜0.05)，见图1。

2 各组大鼠血清指标结果

与sham组相比，SAP组大鼠血清中AMY、ALT 和Cr的水平均显著升高(P＜0.05);与SAP组相比，Oct组大鼠血清中的AMY、ALT和Cr的水平明显降低(P＜0.05)，DCHD组大鼠血清中AMY与ALT的含量水平明显降低(P＜0.05)，Cr的含量水平无显著变化，COM组大鼠血清中的AMY、ALT和Cr的水平显著降低(P＜0.05)，见图2。

Figure 1.Quantity of ascites of rat in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.图1 各组大鼠腹水量的比较

3 各组大鼠胰腺组织的HE染色

Figure 2.The levels of AMY，ALT and Cr in serum of rats in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.图2 各组大鼠血清中AMY、ALT、Cr的含量水平变化

Sham组大鼠的胰腺组织无充血，无炎性细胞浸润以及无水肿;SAP组大鼠的胰腺组织肉眼可见明显出血，腺泡细胞肿大并大量坏死，叶间隔变宽，结构间不清晰，大量炎性细胞浸润;Oct组和DCHD组大鼠的胰腺组织肉眼可见出血情况无SAP组严重，可见有腺泡细胞坏死，叶间隔变宽，有炎细胞浸润;COM组大鼠的胰腺组织有少量出血，腺泡坏死与叶间隔变宽情况有所减轻，见图3。

Figure 3.HE staining of pancreatic tissues of rat in each group(×200).图3 各组大鼠胰腺组织的HE染色

4 Western blot法检测NF-κB与IκBα的蛋白表达水平

Western blot检测结果显示，sham组胰腺细胞核中的NF-κB蛋白几乎不表达，SAP组胰腺细胞核中NF-κB蛋白呈高表达，与SAP组相比，Oct组、DCHD组与COM组胰腺细胞核中的NF-κB蛋白表达显著下降(P＜0.05)，其中以COM组下降幅度最大;与sham组相比，SAP组细胞中IκBα的蛋白表达显著下降(P＜0.05)，与SAP组相比，Oct组、DCHT组与COM组胰腺细胞中 IκBα的蛋白表达有所上升(P＜0.05)，其中COM组的上升幅度最大，见图4。

Figure 4.The protein expression of NF-κB and IκBα in rat pancreatic tissues in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.图4 各组大鼠胰腺组织中NF-κB与IκBα的蛋白表达水平

5 qPCR检测胰腺组织中 ICAM-1与 IL-1的mRNA表达水平

与sham组相比，SAP组大鼠胰腺组织中ICAM-1 与IL-1 mRNA表达显著升高(P＜0.05);与SAP组相比，Oct组、DCHD组与COM组大鼠的胰腺组织中ICAM-1与IL-1的mRNA表达明显升高(P＜0.05)，其中以COM组升高幅度最大，见图5。

Figure 5.The mRNA expression of ICAM-1 and IL-1 in rat pancreatic tissues in each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs SAP group.图5 各组大鼠胰腺组织中ICAM-1与IL-1的mRNA表达水平

讨论

重症急性胰腺炎是消化系统的危重症，病死率极高，患者痛苦，严重危害人类健康，属于临床难治性疾病之一。发病时，胰腺腺泡细胞内的消化酶被激活而产生自身消化，进一步活化中性颗粒，释放蛋白水解酶，导致其它器官损伤。给予生长抑素联合大柴胡汤后，重症急性胰腺炎大鼠的腹水量以及血清中AMY、ALT和Cr的水平均有明显降低，此外，通过HE染色观察到大鼠胰腺组织的炎症情况也得到明显改善，提示生长抑素联合大柴胡汤可能具有减轻症急性胰腺炎的作用。

NF-κB是一种具有多向逆转录作用的蛋白质，是促炎症基因表达的枢纽之一。NF-κB的活化与炎症因子的过度表达，导致细胞因子间的失衡产生级联反应。其中IκBα是NF-κB的主要抑制性调控蛋白，当IκBα磷酸化后，会诱发IκBα被蛋白酶体降解，使得NF-κB迅速转位至细胞核，启动靶基因转录，称为NF-κB的经典激活途径。研究表明，炎症组织中的NF-κB出现活化，中性粒细胞浸润，释放细胞因子，产生氧自由基，导致炎症的加速发展［8－10］。因此，抑制NF-κB的活化可以抑制多种细胞因子的表达并减轻微血管通透性，研究表明在重症急性胰腺炎的动物模型中，抑制NF-κB后淀粉酶、脂肪酶等反映胰腺炎的各项指标均有良好的改善效果，且对脏器也具有一定的保护作用［11］。我们实验发现，重症急性胰腺炎大鼠给予生长抑素联合大柴胡汤后，与单独给予生长抑素或大柴胡汤组相比，更能抑制细胞核中NF-κB的表达，细胞中IκBα表达升高，提示生长抑素联合大柴胡汤的疗效可能是通过抑制NF-κB的经典激活途径而产生作用。此外，ICAM-1是一种单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在内皮细胞、淋巴细胞、上皮细胞等少量表达，受到IL-1、TNF-α等因素刺激后，可激活多条细胞内信号转导途径，造成细胞增生、分化、凋亡与形态变化，以及生成细胞因子等。我们研究发现，与单独给予生长抑素或大柴胡汤的大鼠相比，生长抑素联合大柴胡汤可以抑制细胞中ICAM-1与IL-1。

综上所述，生长抑素联合大柴胡汤具有减轻大鼠重症急性胰腺炎的作用，可能与抑制NF-κB的经典激活途径以及ICAM-1与IL-1的表达有关。

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(责任编辑:陈妙玲，罗 森)

Combined effect of octreotide and Dachaihu decoction on treatment of severe acute pancreatitis

FENG Hui，WU Biao，ZHAO Xi-de，GUO Bao-rui

(Department of Integrated Chinese and Western Medicine，First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453100，China.E-mail:xyfenghui@126.com)

AIM:To investigate the combined effect of octreotide and Dachaihu decoction on the treatment of severe acute pancreatitis(SAP).METHODS:Wistar rats(n=50)were randomly divided into sham group，SAP group，octreotide group，Dachaihu decoction group and combination group.The quantity of ascites was measured.The levels of amylase，alanine aminotransferase and creatinine in the serum were examined.The morphological changes of the pancreatic tissues were observed by HE staining.The activation of NF-κB and IκBα expression were determined by Western blot.The mRNA expression with ICAM-1 and IL-1 was detected by qPCR.RESULTS:Combined treatment with octreotide and Dachaihu decoction effectively reduced the quantity of ascites and the levels of amylase，alanine aminotransferase and creatinine in the serum in SAP rats.Moreover，combined treatment significantly inhibited SAP-induced activation of NF-κB and decrease in IκBα protein expression，accompanied by a decrease in ICAM-1 and IL-1 mRNA expression.CONCLUSION:Combination of octreotide with Dachaihu decoction effectively attenuates SAP by inhibiting NF-κB signaling pathway and ICAM-1 and IL-1 expression.

Severe acute pancreatitis;Octreotide;Dachaihu decoction;NF-κB;ICAM-1;IL-1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.023

1000-4718(2016)07-1297-05

2015-12-02

2016-03-01

△Tel:0373-4402024;E-mail:xyfenghui@126.com