红苋菜提取物抗氧化活性的研究

柴明艳（淄博职业学院，山东淄博255314）

红苋菜提取物抗氧化活性的研究

柴明艳
（淄博职业学院，山东淄博255314）

研究红苋菜不同部位提取物的抗氧化活性。用75%的乙醇溶液，分别对红苋菜的根、茎、叶3个部位进行超声浸提，进一步评价各提取物清除超氧自由基、清除DPPH自由基、清除羟自由基、总抗氧化力与还原力。结果发现，叶部位提取物对超氧自由基清除、DPPH自由基清除和总抗氧化力最强；而茎部提取物清除羟自由基能力最强。红苋菜具有较好的抗氧化活性，其中活性较强的部位为叶。

红苋菜；提取物；抗氧化活性

近年来，随着生活水平的提高与消费观念的转变，人们对食材的营养保健功能愈加重视。为此，国内外科技工作者就药食同源的中草药、香辛料和果蔬等天然植物进行了大量的相关研究[1]。红苋菜（Amaranthus tricolor L.）作为苋科属一年生草本植物，常以蔬菜形式供人们食用，并在我国多地广泛种植。研究发现，红苋菜性味甘凉，散痕利胆，清热解毒，主治黄疽、痢疾、子宫癌等疾病，其功效主要来自于红苋菜中所含多种清热解毒、清肝利胆、抗菌消炎与提高免疫力等生理作用的活性物质，诸如花青素及多糖等有效成分[2-5]。然而有关红苋菜不同部位提取物体外抗氧化的效果研究仍鲜见报道。

本文以乙醇浸提法，分别对红苋菜的根、茎、叶3个部位进行冷浸提取，再评价各提取物清除超氧自由基、清除DPPH自由基、清除羟自由基、总抗氧化能力与总还原力，优选出红苋菜抗氧化最佳活性部位，为其抗氧化功能研究提供试验参考与理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜红苋菜：购自山东淄博学院附近农贸市场，经鉴定为苋菜属植物；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：购于Sigma-Aidrich公司；邻苯三酚：南京化学试剂有限公司提供；其它试剂均为国产分析纯；去离子水由生物制药综合实验室自制。

1.2仪器与设备

酶标仪：美国雷杜RT-6000；7200可见分光光度计：上海佑科仪器有限公司；FA1104型电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-50S1型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Ar2140型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；组织绞碎机：广东南海德丰电热设备厂；LD5-1C离心机：北京医疗仪器修理厂；80-2B型台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3提取物制备

用蒸馏水将红苋菜植株洗净晾干后，按根、茎、叶部位将其分开，再分别称取10、20、30、40、50 g上述样品置于组织绞碎机内进行绞碎，再各加入75%乙醇溶液150 mL，置于室温下浸提3 h，再用超声波辅助提取30 min，将提取液倒出，然后续加溶剂150 mL，如此反复提取3次，分别合并各部位提取液，将其置于4 000 r/min条件下离心5min，最后用旋转蒸发仪浓缩至含生药1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/mL。以上提取液灭菌后放入低温冰箱中保存备用。

1.4方法

1.4.1清除超氧自由基的作用

依据文献报道，以邻苯三酚自氧化法测定各提取物清除超氧自由基的抗氧化作用[6]。首先量取pH 8.20、50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液4.6 mL，再分别加入0.2 mL红苋菜各部位提取液，然后置于25℃下水浴20 min，再加入同温预热的3 mmol/L邻苯三酚溶液（以10 mmol/L HCl溶液配制）0.2 mL，迅速摇匀后于319 nm下每隔1 min测定其吸光值，反复10次，并以10 mmol/L HCl溶液为空白调零，对照组以等体积去离子水替代。依据测定结果，求出吸光度随时间变化曲线的回归方程，所得斜率即为邻苯三酚自氧化的反应速率V1。以同样方法测定不加提取液时即对照组邻苯三酚自氧化时反应速率V2。然后据以下公式计算各提取液去除率：去除率/%=[（V2-V1）/V2]×100。

1.4.2清除DPPH自由基的作用

将不同部位的提取液各2 mL分别加入到干净的10 mL具塞试管中，每管中再加入0.6 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL摇匀，室温避光反应30 min后于515 nm处测定吸光值A1，同时测定溶剂作参比测定其吸光度A0，以及0.6 mmol/L DPPH甲醇溶液吸光度A2，根据公式计算抑制率：抑制率/%=[1-（A0-A1）/A2]×100[7]。

1.4.3清除羟自由基的作用

向10 mL试管中各加入6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、对应提取液2 mL，摇匀后再分别加入2 mL的3 mmol/L H2O2，用去离子水定容至10 mL，混匀置于37℃水浴30 min，再以去离子水为对照，于510 nm处测定各吸光度A1，再以上法测定未加提取液时的吸光度A0，不加H2O2时本底的吸光度A2。清除率计算公式如下：清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100[8]。

1.4.4总抗氧化能力的测定

总抗氧化能力采用Fe3+还原试剂盒法，具体操作方法与结果处理参见南京建成生物工程研究所相应的说明书[9]。

1.4.5总还原能力的测定

往试管中分别依次加入相应提取液、对照溶剂2.5 mL，另加入0.2 mol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液与1%铁氰化钾各2.5 mL，混匀后于50℃恒温水浴20 min，以流水快速冷却，再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混匀后3 000 r/min离心10 min。取上清液2.5 mL，加入去离子水2.0 mL以及0.1%三氯化铁0.5 mL，混匀后反应10 min，于700 nm处测定吸光度，并以抗坏血酸为对照，其值越大表明还原力更强[10-11]。

1.5统计学处理

所有试验数据采用均数加减标准差（Mean±SE）表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析，显著性以0.05 或0.01为标准。

2　结果与讨论

2.1清除超氧自由基能力

O2失去一个电子后便成为一种强氧化剂，即超氧自由基O2-·，可对机体细胞与组织产生比羟自由基都要大的生物毒性[12]。其机理是超氧自由基能与生物大分子作用而引起细胞损伤[13]，正常情况下可由过氧化物歧化酶清除。超氧自由基还是一切氧自由基的前体，经转化可成为其它氧自由基。可见，机体内超氧自由基的清除还能有效减少其它氧自由基的产生，故其意义非常重要。

清除O2-·的能力见图1。

图1　红苋菜提取物清除O2-·的能力Fig.1　Ability of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging O2-·

由图1可知，红苋菜各部位提取物均对O2-·具有清除作用，且与其剂量呈正相关，其中叶中提取物活性最强。

2.2清除DPPH自由基能力

DPPH自由基作为人工合成的自由基，它以氮为中心，其稳定非常好，并在可见光区有特征吸收，具有使用简便、快速与重现性好等特点，故常利用清除DPPH自由基的能力来评价样品抗氧化性能的强弱[14-16]。为此，自1958年首次提出DPPH法后，该法便广泛用于定量评价酚类物质、生物试样与食品的抗氧化能力。另据报道，若受试物能清除DPPH自由基，则显示它具有抑制肾上腺素和亚油酸氧化的功能[17]。

清除DPPH自由基的能力见图2。

图2　红苋菜提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2　Ability of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging DPPH free radical

由图2可知，红苋菜根茎叶3种提取物清除DPPH自由基的能力均较强，并随生药浓度升高而增强，尤其是叶提取物在生药浓度大于4 g/mL时，其清除率可达到85%以上；其它两种提取物的清除能力也较强，提示红苋菜提取物清除DPPH自由基的能力与植株部位有一定的关系。

2.3清除羟自由基能力

细胞受损或抗氧化功能衰减时，机体内将会生成更多的各种自由基，尤其是活性氧自由基中羟自由基具有极强的得电子能力，其反应活性最强，毒性与危害也最大，能与活细胞中的任何生物分子、有机物（如糖类、核酸、氨基酸、蛋白质和脂质等）或无机物发生快速反应，进而造成降解DNA、细胞膜和多糖化合物，并继发众多有害效应，对机体造成严重损害[18-19]。由于羟基自由基与其它分子反应后而全部消失，故其存在时间一般不长，半衰期很短。但是，由其引起的自由基链反应却能在较大范围内对生物体造成损害。为此，展开体内外羟自由基清除的研究具有重要意义，不仅有利于揭示羟自由基损伤的防治机理，还能有助于生化药品与保健食品的筛选及评价。

清除羟自由基的能力见图3。

图3　红苋菜提取物清除羟自由基的能力Fig.3　Ability of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging -OH free radical

由图3可知，红苋菜三部位提取物对羟自由基清除能力随生药浓度的加大而增高，尤其是在生药浓度大于4 g/mL时，其生物活性依次为茎＞叶＞根，相应的清除率分别为89.2%、86.5%与81.4%。可见，红苋菜三部位提取物均具有较强的抗氧化活性。

2.4总抗氧化力

FRAP法测定总抗氧化能力的原理：机体内抗氧化物质可将Fe3+还原成Fe2+，而后者能和菲啉类物质形成稳固的蓝色络合物，再通过比色可测出络合物的生成量，即可反映出待测样品抗氧化能力的高低[20]。本试验定义总抗氧化力单位：在37℃时，每分钟每毫升提取物使反应体系的吸光度值每增加0.01时，为一个总抗氧化单位。由于FRAP法是针对样品总的自由基清除能力及其还原能力，故以此来反映样品总的抗氧化活性[21]。

采用FRAP法测定红苋菜各部位提取物的总抗氧化能力见表1。

表1　红苋菜提取物总抗氧化力Table 1　Total Antioxidant activity of Amaranthus tricolor L. extracts

由表1可知，总体上，叶的提取物抗氧化能力最强，茎部次之，根部最小。从表1结果还可看出，低浓度生药条件下，各部位的抗氧化能力非常接近，而在高浓度时，其抗氧化能力差别极明显。该结果显示，红苋菜提取物的总抗氧化能力不仅与其提取部位相关，还和各自的生药浓度呈剂量依赖性。

2.5总还原能力

研究已证实，在某种程度上物质还原能力越强，越不容易被氧化，其抗氧化性就越高。因此，总还原力与抗氧化活性具有相关性，并能明显反映内源抗氧化活性的变化，现已成为评价抗氧化活性的重要指标之一[22-24]，也是物质抗氧化作用的主要机理[25]。

红苋菜提取物的总还原能力见图5。

图5　红苋菜提取物总还原能力Fig.5　Totalreducing power of Amaranthus tricolor L.extracts

从图5可以看出，随着生药浓度的增大，红苋菜提取物的总还原能力逐渐增强，呈正的量效关系，且各部分的还原能力大小依次为：叶部>茎部>根部。在叶部生药浓度5 g/mL和抗坏血酸浓度为50μg/mL时，二者的总还原能力基本相当。结果表明，红苋菜提取物具有较强的总还原能力，可作为电子供应者，能与自由基反应生成较稳定的复合物，从而中断链式氧化反应。

3　结论

生物体借助氧化过程可为机体提供所需的代谢能，但也会产生相应的各种氧自由基，如单线态氧、羟自由基、超氧阴离子自由基与过氧化自由基等[26]。正常情况下，机体内自由基的生成与清除处于相对平衡，因体内自身存在抗氧化系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）及过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶，它们能及时清除体内过多的自由基，可防止后者积累过量引起氧化应激，以避免生物大分子不可逆的破坏而造成机体损伤、疾病与衰老[27-28]。因此，当机体因衰老或疾患而导致自由基不能及时清除，可通过外源摄入抗氧化剂直接清除过量的自由基，或增强体内抗氧化系统而达到抗氧化目的[29]。

依据自由基理论[30]，当前常用清除人工合成自由基的能力来评价活性物质的抗氧化作用。本文就红苋菜根茎叶三部位提取物进行了体外抗氧化活性的探索性研究。综合各提取物清除超氧自由基、DPPH自由基、羟自由基，及其总抗氧化力与总还原力的结果，可确定红苋菜抗氧化的活性成分主要分布于叶片，茎部次之。其中叶部位提取物具有较强的超氧自由基与DPPH自由基清除能力，以及总抗氧化力；而茎部提取物对羟自由基的清除能力略强。研究提示，红苋菜具有较好的抗氧化活性，并以叶部提取物活性较强。以上研究可为红苋菜抗氧化活性的深入探讨及其功能开发提供科学参考。

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Antioxidant Activity of Extracts from Amaranthus tricolor L.

CHAIMing-yan
（Zibo Vocational Institute，Zibo 255314，Shandong，China）

Antioxidant activity ofextracts from different parts of Amaranthus tricolor L.was studied.Using 75% ethanolsolution，roots，stems and leaves of Amaranthus tricolor L.were conducted to ultrasonic extraction，respectively.Further more，the effects of Amaranthus tricolor L.extracts on scavenging superoxide free radical，DPPH radical and hydroxyl radical，total antioxidant capacity and reducing power were evaluated.The results found thatleaf extracts from Amaranthus tricolor L.showed the strongesteffects on scavenging superoxide radical and DPPH free radical，and had the biggest total antioxidant capacity，while the stem extract had the strongest effects on scavenging hydroxyl free radical.Different parts of Amaranthus tricolor L.especially leaves have a good antioxidant activity.

Amaranthus tricolor L.；extract；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.005

山东省科学技术发展计划项目（2011GSF12108）

柴明艳（1983—），女（汉），讲师，硕士，主要从事生物发酵方面的教研工作。

2015-06-14