雷公藤红素增强TNF-α对膀胱癌细胞系T24凋亡诱导效应及机制研究

翁旭东（宁波市鄞州人民医院，浙江宁波315040）

雷公藤红素增强TNF-α对膀胱癌细胞系T24凋亡诱导效应及机制研究

翁旭东
（宁波市鄞州人民医院，浙江宁波315040）

目的研究雷公藤红素是否能增强TNF-α对膀胱癌细胞的杀伤活性及机制。方法用MTT法及AnnexinⅤ染色法检测TNF-α单独治疗及联合雷公藤红素治疗对膀胱癌细胞系T24细胞活力及凋亡的影响。将T24细胞用雷公藤红素和TNF-α处理后，用免疫共沉淀及Western blot方法检测RIP1蛋白与FADD及caspase-8的相互作用。雷公藤红素和TNF-α处理后，用Western blot方法检测T24细胞cIAP1的表达水平。用Lipofectamine 2000试剂将cIAP1表达质粒转染入T24细胞，再用MTT法、AnnexinⅤ染色法、免疫共沉淀及Western blot方法检测雷公藤红素联合TNF-α对T24细胞凋亡通路的影响。结果雷公藤红素能显著增强低浓度TNF-α对T24细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性，并增强TNF-α对RIP1的活化，增加RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成。雷公藤红素能显著下调T24细胞cIAP1的表达水平，转染cIAP1表达质粒后，雷公藤红素对TNF-α的凋亡促进作用丧失。结论雷公藤红素通过抑制cIAP1的表达增强TNF-α对膀胱癌细胞系T24的凋亡诱导效应。

雷公藤红素；TNF-α；cIAP1；凋亡

肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种炎症细胞因子并且具有抗肿瘤的作用［1］。研究发现，TNF-α能显著抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和转移，并能直接诱导膀胱癌细胞发生凋亡［2］。然而要获得比较好的抗肿瘤疗效，所需TNF-α的剂量较大，由此带来的毒性作用患者往往无法耐受［3］。雷公藤红素是一种三萜类化合物，来源于中药雷公藤的根皮，具有多种生物活性。研究发现雷公藤红素具有一定的抗肿瘤效应，如在体外诱导前列腺癌细胞发生自噬性死亡［4］，还能通过诱导活性氧簇的生成引起结肠癌细胞凋亡［5］。本文探讨雷公藤红素是否能提高膀胱癌细胞对TNF-α的敏感性并研究其机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞培养本研究从2013年1月～2015年8月完成于本院实验室。人膀胱癌细胞系T24购于美国模式菌种收集中心（ATCC）。细胞系培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并将细胞置于37°C恒温培养箱中培养，通入5%CO2。

1.1.2实验试剂RPIM-1640培养基 （#11875-085）购于美国Gibco公司，胎牛血清（HB0205）购于杭州四季青生物工程有限公司。TNF-α（H8916）、MTT（噻唑蓝，M2128）、雷公藤红素（C0869）、AnnexinⅤ凋亡试剂盒（APOAF）、琼脂糖蛋白A小珠购于美国 Sigma-Aldrich。Lipofectamine 2000 （11668030）购于美国 Invitrogen。抗 β-actin （#4967）、抗RIP1（receptor-interacting protein，受体相互作用蛋白1，#3493），抗cIAP1（cellular inhibitor of apoptosis protein-1，细胞凋亡抑制因子 1，#7065）、抗caspase-8（#4790）、抗FADD（Fasassociated with death domain protein，Fas相关死亡域蛋白，#2782）购自美国Cell signal公司。ECL试剂盒（NCI4106）购于美国Pierce。

1.2方法

1.2.1MTT法检测药物对肿瘤细胞的杀伤活性将T24细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、雷公藤红素单治疗组、TNF-α单治疗组及雷公藤红素联合 TNF-α治疗组。分组后将细胞用1μmol/L雷公藤红素和10 ng/mL TNF-α处理48小时，之后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4小时。弃上清，在570nmol/L波长下用酶标仪检测OD值，细胞活力抑制率用以下公式计算:抑制率=（OD对照组-OD治疗组）/OD对照组×100%。

1.2.2细胞凋亡试验将T24细胞按5×105/孔接种在6孔板上，分为对照组、雷公藤红素单治疗组、TNF-α单治疗组及雷公藤红素联合TNF-α治疗组。分组后将细胞用1μmol/L雷公藤红素和10 ng/mL TNF-α处理48小时。之后收集细胞，按照试剂说明书将AnnexinⅤ加入细胞中孵育20分钟，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，细胞凋亡率用AnnexinⅤ阳性细胞占所有细胞比值表示。

1.2.3免疫共沉淀及 Western blot试验将T24细胞按5×105/孔接种在6孔板上，分为对照组、雷公藤红素单治疗组、TNF-α单治疗组及雷公藤红素联合TNF-α治疗组。分组后将细胞用1μmol/L雷公藤红素和10 ng/mL TNF-α处理48小时。收集细胞，将细胞用生理盐水洗涤2遍后用蛋白提取液提取总蛋白质。在蛋白提取液中加入RIP1一抗4℃孵育过夜，加入琼脂糖蛋白 A小珠孵育2小时，使琼脂糖蛋白 A与RIP1抗体充分结合，将样品用蛋白提取液洗涤2遍后用十二烷基硫酸钠（SDS）缓冲液煮沸。煮沸后的样本用12.5%SDSPAGE进行电泳分离，分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到 PVDF膜上，用 RIP1、FADD、caspase-8或β-actin单克隆抗体孵育过夜，再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2小时，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.2.4质粒构建及转染将cIAP1基因的开放阅读框架全序列（Gene ID:NM_001166）以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成 pcDNA3.1-cIAP1重组真核表达质粒［4］，质粒的转染使用Lipofectamine 2000按照试剂操作说明书步骤进行，将pcDNA3.1-cIAP1或pcDNA3.1空载体（2μg/mL）转染入T24细胞中，培养24小时，再用MTT法、AnnexinⅤ染色法、免疫共沉淀及Western blot方法检测雷公藤红素联合TNF-α对T24细胞凋亡通路的影响。

2　结果

2.1雷公藤红素增强TNF-α对T24细胞的凋亡诱导效应MTT和凋亡实验结果表明联合雷公藤红素能显著提高TNF-α对T24细胞的杀伤活性和凋亡诱导能力（表1）。

表1雷公藤红素增强TNF-α对T24细胞的凋亡诱导效应（±s）

表1雷公藤红素增强TNF-α对T24细胞的凋亡诱导效应（±s）

与雷公藤红素单治疗组比较*P＜0.05，与TNF-α单治疗组比较△P＜0.05

细胞凋亡率（%）对照组　3　0　2.6±0.5雷公藤红素单治疗组　3　7.9±1.1　6.1±1.2 TNF-α单治疗组　3　7.4±1.4　7.7±1.5雷公藤红素+TNF-α治疗组　3　59.8±4.4*△　48.6±3.0*△组别　n/孔　细胞活力抑制率（%）

2.2雷公藤红素联合TNF-α诱导RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成TNF-α单独治疗仅能微弱地诱导RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成，联合雷公藤红素后，RIP1与FADD及caspase-8的相互作用显著增强（图1）；雷公藤红素联合TNF-α能显著诱导caspase-8的活化（图2）。

图1　雷公藤红素联合TNF-α诱导RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成

图2　雷公藤红素联合TNF-α诱导caspase-8活化

图5　cIAP1质粒抑制雷公藤红素联合TNF-α对caspase-8的活化作用

2.3雷公藤红素通过下调cIAP1的表达水平发挥对TNF-α的协同效应雷公藤红素处理后，T24细胞的cIAP1表达水平显著下调，而TNF-α对cIAP1的表达无影响 （图3）。在T24细胞中转染cIAP1表达质粒后，雷公藤红素对TNF-α的协同抗肿瘤效应受到抑制（表2），RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成也相应减少（图4），进而使caspase-8的活化受到抑制（图5）。

图3　雷公藤红素显著下调T24细胞cIAP1的表达水平

表2　cIAP1表达质粒抑制雷公藤红素对TNF-α的协同抗肿瘤效应（±s）

表2　cIAP1表达质粒抑制雷公藤红素对TNF-α的协同抗肿瘤效应（±s）

与雷公藤红素+TNF-α治疗组比较*P＜0.05

组别　n/孔　细胞活力抑制率（%）细胞凋亡率（%）对照组　3　0　2.8±0.5空载体组　3　1.7±0.5　3.7±0.6雷公藤红素+TNF-α治疗组　3　61.5±4.6　49.4±3.1 cIAP1质粒+雷公藤红素+ TNF-α治疗组　3　21.2±2.1*　14.7±1.7*

图4　cIAP1质粒抑制雷公藤红素联合TNF-α对RIP1-FADD-caspase-8复合物形成的诱导作用

3　讨论

膀胱癌在泌尿生殖系统中是常见的恶性肿瘤，其发生率在男性中仅次于前列腺癌［6］。雷公藤红素是一种三萜类化合物，来源于中药雷公藤的根皮，具有多种生物活性。在本研究中，作者同样发现雷公藤红素单独治疗有微弱的抗膀胱癌的生物活性，而更为重要的是，雷公藤红素还能显著增强TNF-α对膀胱癌细胞的凋亡诱导效应。

TNF-α是细胞凋亡的重要调节分子，能诱导肿瘤细胞发生凋亡。当TNF-α受体与TNF-α结合后，细胞质中游离的RIP1蛋白被募集到TNF-α受体上与之结合。RIP1蛋白随即在去泛素化酶的作用下脱去泛素而发生活化，活化的RIP1蛋白能结合FADD 和caspase-8，形成RIP1-FADD-caspase-8复合物，复合物上的caspase-8随即活化并激活凋亡途径［7-8］。cIAP1蛋白是细胞内重要的凋亡抑制分子，它能使RIP1蛋白发生泛素化从而抑制RIP1蛋白的活性，减少RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成［9］。研究表明cIAP1蛋白在肿瘤细胞中往往会发生过表达，cIAP1已成为肿瘤治疗的靶点，如用干扰RNA沉默卵巢癌cIAP1的表达后，肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性显著提高［10］，而cIAP1在胃癌细胞中的稳定高度表达会诱导肿瘤细胞发生化疗药物耐药［11］。

在本研究中，为了探讨雷公藤红素增强TNF-α凋亡诱导能力的机制，作者通过免疫共沉淀和Western blot实验发现在联合雷公藤红素后，TNF-α诱导的RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成显著增加，提示两者联合能诱导T24细胞发生caspase-8依赖的凋亡。由于RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成受cIAP1蛋白的负调控，作者推测雷公藤红素发挥对TNF-α的协同作用可能和cIAP1蛋白有关，而进一步的研究发现，雷公藤红素能显著下调T24细胞cIAP1蛋白的表达水平。为了证实雷公藤红素发挥对TNF-α的协同作用是通过抑制cIAP1蛋白的表达，作者构建了cIAP1表达质粒并将其转染到T24细胞中，使之强制表达cIAP1蛋白。研究发现，转染cIAP1表达质粒后，雷公藤红素联合TNF-α对T24细胞的杀伤活性和凋亡诱导能力显著下降，同时RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成也显著减少，caspase-8的活化受到抑制。

综上所述，本研究证明了雷公藤红素具有TNF-α增效的作用，其分子机制可能为通过下调cIAP1的表达促进RIP1-FADD-caspase-8复合物的形成，从而诱导膀胱癌细胞发生caspase-8依赖的凋亡。这些实验结果为雷公藤红素与抗肿瘤药物联合治疗膀胱癌提供了理论依据。

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