法舒地尔对百草枯致大鼠肺纤维化的干预作用

周挺，夏菁，李增攀，徐丽艳，韩文文，方建江（宁波市医疗中心李惠利医院，浙江 宁波315000）

法舒地尔对百草枯致大鼠肺纤维化的干预作用

周挺，夏菁，李增攀，徐丽艳，韩文文，方建江*
（宁波市医疗中心李惠利医院，浙江 宁波315000）

目的观察急性百草枯（PQ）中毒大鼠肺组织转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达水平及法舒地尔对其的干预作用。方法将72只SPF级SD大鼠随机分为正常对照组、法舒地尔对照组、PQ中毒组、法舒地尔干预组各18例，分别于灌胃后7、14、28天活杀大鼠留取标本。观察大鼠行为学改变，HE和Masson染色观察大鼠肺组织病理改变，实时荧光定量PCR及免疫组化法检测TGF-β1的表达水平。结果光镜下，PQ中毒组大鼠急性肺损伤及纤维化明显，法舒地尔干预组大鼠肺组织损伤程度较PQ中毒组减轻。与正常对照组比较，PQ中毒组大鼠肺组织7、14、28天TGF-β1 mRNA及蛋白的表达量显著增高，于28天达峰值，差异有统计学意义（均P＜0.01）；与同一时间PQ中毒组比较，法舒地尔干预组小鼠肺组织TGF-β1mRNA及蛋白表达量明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论法舒地尔可以抑制百草枯中毒大鼠肺组织TGF-β1的表达，从而减轻大鼠肺纤维化程度。

百草枯；肺纤维化；转化生长因子-β1；法舒地尔

百草枯（paraquat，PQ）是目前全球使用最广泛的除草剂之一，口服中毒者短期内可出现多脏器功能障碍，数天内致死，度过急性期的患者最终多数死于肺纤维化［1］。转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）是众多纤维化疾病发生发展的重要因子［2］，日益引起大家重视。近年来发现法舒地尔作为一种高效的血管扩张药，可以干预多种器官纤维化进程。本研究通过PQ灌胃染毒建立大鼠肺纤维化模型，检测TGF-β1的动态变化，探讨法舒地尔对百草枯致大鼠肺纤维化的干预作用。

1　材料与方法

1.1材料动物:SPF级健康雄性SD大鼠72只，200～230g，10周龄左右，由浙江省实验动物中心提供，动物合格证号为:SCXK（浙）2014-0001，实验大鼠由宁波大学动物实验中心饲养，维持室温22～25℃，湿度45%～55%，喂食颗粒饲料，实验前8小时禁食，4小时禁水。试剂:注射用法舒地尔（批号: h20040356，天津红日药业股份有限公司生产），20%百草枯溶液 （山东济南天海科技有限公司，批号:4685-14-7）；TGF-β1抗体、免疫组化试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）。

1.2方法72只SPF级SD大鼠随机分为4组，即正常对照组、法舒地尔对照组、PQ中毒组及法舒地尔干预组。各组再按随机原则分为7、14、28天三个亚组，每个亚组6只大鼠。具体分组及方法见表1。各组大鼠于灌胃后第7、14、28天分批处死。开胸完整取出肺组织并观察整体肺的变化情况，左上肺置于4%甲醛中固定，制备石蜡切片供组织学检查、HE染色、Masson染色及免疫组化，其余肺组织入-70℃低温冰箱保存，待测时制备肺组织匀浆。观察各组大鼠行为学改变、肺组织病理学改变、TGF-β1mRNA的表达以及TGF-β1蛋白的表达。

表1　各组的实验方法

1.3检测指标

1.3.1病理学大鼠肺组织经4%甲醛固定后，脱水、包埋、连续切片，进行HE、Masson染色，光学镜下观察肺组织病理学改变；参照 Szapie等［3］方法，用Masson染色评定肺组织纤维化程度。

1.3.2TGF-β1mRNA的表达 严格按照 Realtime PCR操作流程操作，提取大鼠肺组织RNA进行检测。引物由上海基康生物有限公司合成。TGF-β1（长度95bp，上游5'-AGTCCCTGATGA CATTCCTTCTT-3'下游5'-CAAG TTTG AG A GGTGGTGTAAGC-3'）。

1.3.3TGF-β1蛋白的表达采用链霉亲和素-过氧化物酶法（SABC）检测，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。TGF-β1免疫组化结果以胞质出现棕色或棕黄色为阳性，每张切片在400倍视野下随机取5个视野，用高清晰图像分析系统半定量分析阳性表达部位TGF-β1蛋白的表达水平，计算其平均吸光度值（MOD）作为表达水平的半定量参数。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计软件，计量数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，方差不齐则进行秩和检验。

2　结果

2.1大鼠行为学改变PQ中毒组染毒后大鼠出现呼吸急促、精神萎靡、反应迟钝、攻击性降低、鼠毛蓬松粗糙、色泽黯淡等表现，同时间段法舒地尔干预组大鼠其呼吸急促、精神萎靡、反应迟钝、毛发蓬松等表现相对较轻。

2.2肺组织病理学改变PQ中毒组光镜下可见明显肺泡炎，肺泡间隔水肿，间质内可观察到炎性细胞聚集充血，肺泡结构破坏，随时间延长，肺泡间隔增宽，成纤维细胞集聚（图1C）；法舒地尔干预组肺泡炎较PQ中毒组减轻，渗出及充血减少，肺组织结构破坏减轻，肺泡间隔增宽不明显（图1D）。PQ中毒组大鼠肺组织蓝染部分明显，色暗质硬，部分区域表面凹凸不平，切片时韧度增加（图2C）；法舒地尔干预组损伤程度较轻、范围较小，韧度较轻（图2D）。

图1　大鼠肺组织HE染色后的病理学改变（×400）（1A:正常对照组；1B:法舒地尔对照组；1C:PQ中毒组；1D:法舒地尔干预组）

图2　大鼠肺组织Masson染色后的病理学改变（×400）（2A:正常对照组；2B:法舒地尔对照组；2C:PQ中毒组；2D:法舒地尔干预组）

2.3TGF-β1mRNA的表达 正常对照组与法舒地尔对照组大鼠肺组织TGF-β1mRNA呈低表达，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与正常对照组比较，PQ中毒组大鼠肺组织 7、14、28天 TGF-β1mRNA表达量显著增高，于28天达峰值，差异有统计学意义（P＜0.01）；同一时间段法舒地尔干预组大鼠肺组织TGF-β1mRNA表达量较PQ中毒组明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。详见表2。

表1 各组大鼠肺组织TGF-β1mRNA的表达（±s，×103）

表1 各组大鼠肺组织TGF-β1mRNA的表达（±s，×103）

与正常对照组比较**P＜0.01，与PQ中毒组比较△△P＜0.01

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2.4TGF-β1蛋白的表达正常对照组与法舒地尔对照组大鼠肺组织TGF-β1蛋白呈低表达，两组比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；与正常对照组比较，PQ中毒组大鼠肺组织7、14、28天TGF-β1蛋白的表达量显著增高，于28天达峰值，差异有统计学意义（P＜0.01）；同一时间法舒地尔干预组小鼠肺组织TGF-β1蛋白表达量较PQ中毒组显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。详见表3。

表3　各组大鼠肺组织TGF-β1蛋白的相对表达（±s）

表3　各组大鼠肺组织TGF-β1蛋白的相对表达（±s）

与正常对照组比较**P＜0.01，与PQ中毒组比较△△P＜0.01

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3　讨论

百草枯是一种非选择性接触型除草剂，目前尚无特效解毒药，已成为农药中毒致死事件的常见病因。百草枯中毒可引起多脏器的损伤，尤以肺脏最为突出，早期主要以急性肺泡炎为主，细胞水肿，肺泡塌陷，肺毛细血管通透性增加，血细胞、体液大量进入肺泡腔内，影响通气功能［4］。随着百草枯诱导的急性肺泡炎进一步发展，成纤维细胞增生趋化，胶原蛋白沉积，最终导致肺纤维化［5］，其致纤维化机制复杂，目前尚未完全阐明。TGF-β1是目前所知最强的致纤维化因子，是纤维化形成与发展的启动枢纽，能引起成纤维细胞趋化，促进胶原蛋白合成，改变细胞外基质成分［6］。有研究表明，PQ中毒时在氧代谢产物等作用下，大量释放各种TGF-β因子，启动肺组织的炎症和纤维化过程［7-8］，促进肺成纤维细胞趋化和上调I、III型前胶原基因表达［9］。因而通过检测TGF-β1的表达可以间接反映肺组织纤维化的程度。法舒地尔是ROCK选择性阻断剂，是目前唯一应用于临床的抑制Rho/ROCK信号通路的药物，近年法舒地尔在抗纤维化方面的作用日益引起重视。王玉珍等［10］研究发现法舒地尔可以减缓肝脏纤维化的进程，在肾间质纤维化［11］及心脏纤维化［12］等方面也有干预作用。目前，法舒地尔对肺纤维化治疗方面的研究尚少，更无干预百草枯中毒致肺纤维化的研究报道。

本实验成功复制了百草枯中毒致肺纤维化的大鼠模型，光镜下可见PQ中毒组大鼠肺泡塌陷，肺间质水肿以及炎细胞浸润 （图1C），Masson染色显示蓝染部分明显，色暗质硬，部分区域表面凹凸不平，纤维蛋白沉积增加，同时肺组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达增加（图2C），与正常对照组比较差异显著，而经法舒地尔干预后，大鼠肺组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达与较PQ中毒组明显降低。上述结果表明，法舒地尔可以降低百草枯中毒大鼠肺组织TGF-β1的表达水平，改善百草枯致大鼠肺纤维化的严重程度，同时也提示Rho/Rho激酶信号通路可能参与了PQ致肺纤维化过程，但更为详细的机制还有待于进一步研究。

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，E-mail：fangjjiang@sina.com

宁波市医学科技计划项目（2013A03）
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