一种油茶叶脉临时装片制作与显微观察方法

廖 阳 殷小林 许路路 闫荣玲

(湖南科技学院化学与生物工程学院 永州 425199)

叶片作为光合作用的场所，对于植株的正常生长发育、新陈代谢等生命活动意义重大。叶脉是叶片中的维管组织，如同动物体内的“毛细血管”，为叶片输送水分与无机离子。不同进化地位及不同种类植物的叶脉特征存在不同程度差异[1，2]。人们提出了一系列性状指标来表征叶脉的结构特征及其对叶片功能的影响[3]。研究表明，叶脉的结构特征一方面会受到环境因子如水分、温度、光照等因素的影响[3，4]；另一方面，叶脉的形态特征也是植株是否健康的重要表征[5～7]。因此，叶脉分析是植物学研究的一个重要要素。作为一种木本油料作物，油茶(Camelliaoleifera)的叶片除了常绿、光滑、边缘锯齿等特点外，还表现出叶厚、覆蜡、革质等特征，不利于其叶脉的观察。本文通过对已有方法进行改进，摸索建立一种简单易行的油茶叶脉显微观察的方法，可为开展相关研究提供参考。

1 实验原理

油茶叶片分别置于一定浓度的乙醇和氢氧化钠溶液进行煮沸处理。在煮沸过程中，叶肉细胞逐渐被破坏，同时乙醇和氢氧化钠会使细胞中的蛋白质变性，破坏叶片中的色素并对组织产生腐蚀作用，从而加快了叶肉细胞的破损速度。前期摸索确定乙醇与氢氧化钠的浓度分别均为80%与80%。但在此过程中，叶脉作为维管组织，较难破坏而得以保留其形态与分布特征。

2 实验材料、器材与试剂

实验材料：新鲜油茶叶片。

实验器材：光学显微镜、恒温水箱、镊子、电子天平、容量瓶(500 mL)、烧杯、药匙、称量纸、剪刀、玻璃棒、量筒。

实验试剂：75%乙醇溶液(现配)、80%NaOH溶液(现配)。

3 操作步骤

(1)取新鲜油茶叶片，清水洗净备用。

(2)将配置好的75%乙醇与80%NaOH溶液，置于恒温水箱中加热至沸腾。

(3)将风干的新鲜油茶叶片置于煮沸的75%乙醇中，5min后用镊子取出置干自来水下冲洗至无明显变化。

(4)再将叶片置于煮沸的80% NaOH溶液中，15～20 min后用镊子取出置干自来水下冲洗至叶肉全部脱落。若叶肉未能洗脱完全，可再次放入煮沸的NaOH中处理，并根据情况确定持续时间(5～10min)，直至呈现出完整、清晰的叶脉网络。整个过程中不需要其他工具对被破坏的叶肉进行额外处理。

(5)将得到的叶脉用吸水纸轻轻吸干，置于载玻片上进行显微观察(与拍照)。

4 实验结果

如图1所示，经上述步骤处理后，在显微镜下可以清晰地观察到油茶叶片的叶脉形态特征与网络分布。从图上可以看出，油茶叶片的叶脉密度较大，几乎布满整个叶片。根据叶脉直径，可明显分为三级，分别是Ⅰ级大叶脉(箭头所示)，Ⅱ级：中叶脉(圆圈所示)，Ⅲ级：细叶脉(矩形所示)。

图1 油茶叶片叶脉分布与形态特征(40倍)

显示：Ⅰ级大叶脉(箭头所示)，Ⅱ级：中叶脉(圆圈所示)，Ⅲ级：细叶脉(矩形所示)。

5 注意事项

(1)试验中用到强碱溶液，在试剂配制以及煮沸过程中要注意安全，防止液体飞溅到皮肤或眼睛。

(2)实验中若在NaOH溶液持续煮沸15～20 min后，存在部分叶肉不能直接冲掉的个别情况时，只需再次放入延长煮沸3～5 min即可。

(3)实验所用试剂需现配现用。

(4)装片置载玻片上时，需小心展平。

6 小结

油茶叶片的叶片表面覆盖蜡质，且叶片较厚，颜色较深。因此，要获得完整、清晰、无杂质的叶脉临时装片相对较难。因此，在实验方案确定过程中，一方面把乳酸或碳酸氢钠等试剂换成了强碱性的氢氧化钠[8]。另一方面，加大乙醇与氢氧化钠的浓度，均达到或超过75%。由图可知，这种针对油茶叶片(以及具有类似特征的植物叶片)的叶脉显微观察方法有效可行，所获装片的叶肉清除彻底，叶脉完整无损，在显微镜下可清晰观察到叶脉的整体分布，根据叶脉粗细可划分其为不同等级。值得注意的是，在叶片经过上述实验步骤的处理后，直接在自来水下进行冲洗即可去除全部叶肉组织，不需其他额外操作(如用牙刷辅助去除叶肉)，这样可以最大限度地保护叶脉的完整性。