乙型肝炎基因分型的研究进展*

张桂前，高建梅，孙　鹥 综述，段　勇 审校

(1.云南省第一人民医院检验科，昆明 650032；2.昆明医科大学第一附属医院检验科，昆明 650032)



·综述·

乙型肝炎基因分型的研究进展*

张桂前1，高建梅1，孙鹥1综述，段勇2△审校

(1.云南省第一人民医院检验科，昆明 650032；2.昆明医科大学第一附属医院检验科，昆明 650032)

乙型肝炎；基因分型；乙型肝炎病毒

乙型肝炎(简称乙肝)病毒(HBV)感染是严重的公共卫生问题，全球约20亿人感染过HBV，其中3.5亿人成为了慢性HBV感染者[1]，约15%～40%的HBV感染者最终发展成为了肝硬化或肝癌[2]，全球每年约100万人死于乙肝所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌。HBV的感染呈地方性流行，超过75%的HBV感染者分布于西太平洋地区和东南亚国家，乙肝表面抗原(HBsAg)携带率在西欧、北美仅0.1%～0.9%，而在亚洲国家高达5%～10%。中国累计有7亿人曾感染过HBV，有1.2亿人成为了病毒携带者，每年约60万人死于HBV感染引起的相关疾病。HBV感染的临床转归不仅与患者年龄和免疫力有关，而且也与病毒株的基因型密切相关，所以研究HBV基因型有重要的临床意义。通过HBV基因分型，可以了解基因型的地区分布特点以及在人群中的变异和进化趋势。

1　概　述

HBV属于嗜肝病毒的一种，核酸为部分共价闭合环状双链DNA，其双链长度不同，与病毒mRNA互补全长的一条链为负链，而另一条为正链，长度不定，约为负链的50%～100%。病毒基因组长度在3 182～3 221个核苷酸， 含4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即前S/S区、前C/C区、P区和X区。S-ORF分为前S1区、前S2区和S区，各有其起始密码子ATG,编码大、中、小3种包膜蛋白；C-ORF分为前C区和C基因区，各自有起始密码ATG，编码HBeAg及HBcAg，这一区段最保守，是免疫攻击的靶表位所在；P-ORF 是最长的阅读框，与C-ORF、S-ORF、X-ORF重叠，编码病毒聚合酶；X-ORF编码HBx蛋白，HBx是一种多功能的反式调节因子，可反式激活增强子和启动子的转录功能。在病毒基因组上，不仅有编码蛋白的结构基因，还有调节元件，包括4个启动子、2个增强子、糖皮质激素应答元件、负调节元件、CCAAT元件等。由于HBV复制过程中需经过RNA中间体的逆转录，而该逆转录酶又缺乏校正功能，所以HBV具有高变异性，其突变率约为(1.4～3.2)×10-5位点/年。因此，在生活环境和免疫压力下，HBV不断变异从而形成了不同的准种、基因型和基因亚型。

2　乙型肝炎的基因分型和流行分布

由于全基因序列分析比较复杂，HBV旧的分型原则可根据部分基因特别是S基因序列进行分型，因为S基因的序列相对其他序列而言异质性最小，也更加保守，从而根据S区基因序列的异质性≥4%的标准代替全基因序列分型。但新近提出的分型原则认为必须要以全基因组序列作为分型依据，并纠正了一些错误分型。例如，Khedive等[3]对伊朗的HBV携带者681 bp的分离株进行分析，报告了5株亚型(D5和D8)，这与已知的地理分布不一致；以及Shi等[4]对B3亚型的错误分型等。目前HBV有8个证实基因型(A至H)和2个暂定基因型(I和J)[5]。其中，基因型A又进一步分为A1～A7亚型；B型分为B1～B9亚型；C型有C1～C16亚型；D型有D1～D8亚型；基因型F只有4种亚型F1～F4；其他基因型目前还未发现亚型存在。

基因型分布在不同的地区和不同的人种中。有关HBV基因型研究表明，B和C基因型主要分布在亚洲，而欧洲最常见的基因型是A和D型[6]。地中海、中东、中亚地区以D型为主，北美地区C型为主，其次是A和B型，H型少量分布在美国中部。印度的基因型以D型为主，D型是全球分布最广的基因型，E型是西非的优势亚型，F型是在南美洲和中美洲发现的。G型是目前HBV基因分型中最少见的一个型，它是2000年时由来自美国和法国的标本中分离的。G型导致感染是通常要有其他型的HBV存在，最常见的就是G型合并A2型，因为A2型能够增强G型病毒的复制[7]。我国以B和C两种基因型为主，也有少量的A和D基因型和B/C基因型混合感染，其中北方以C型为多，南方以B型占优势，各省之间并不完全相同[8]。越来越多的研究表明在不同的国家、地区和人群中流行的HBV存在基因型上的差异。见表1。

表1　HBV基因型的地理分布表[9-14]

3　HBV基因分型的方法

至今HBV基因分型的检测方法主要包括以下 10 种[15-17]：

3.1全基因测序法全基因测序法是PCR扩增HBV全基因DNA，扩增产物经胶回收后进行测序并做种系进化统计，分析不同病毒株之间的亲缘关系，得出各病毒株的型别，该方法是分析和确定基因型的最准确方法，也是 HBV 基因分型的金标准。但耗时、费用高，不适用于大规模流行基因病学调查。

3.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 基因分型法PCR-RFLP基因分型法是先将待测的靶DNA片段进行扩增，再用限制性核酸内切酶对扩增产物进行酶切，不同基因型的序列产生的限制性片段数目和长度不同，最后经电泳分析靶DNA片段而分型。此法不需杂交和测序，是一种有效、简便的分型方法，适用于流行病学调查研究。缺点是：酶切位点易受基因变异的影响，且混合感染或酶切不完全时，会出现复杂条带，影响结果判断。

3.3单克隆抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)分型法单克隆抗体ELISA分型法是根据HBV前S2区的特异性表位设计特异的单克隆抗体，并用辣根过氧化物酶进行标志，一般采用双抗体夹心法分析联合检测，可以得到各待测标本的表位组合，这些表位与基因型存在对应关系，根据单克隆抗体表位鉴定出不同的基因型。该方法操作简便，可用于大样本的检测。但对一些混合型感染和HBsAg低水平表达的标本可能无法鉴别。

3.4型特异性引物-PCR分型法型特异性引物-PCR分型法是对HBV各型别全序列或某目标序列(S区)进行比对分析，找出每种基因型的独特序列，设计相应的引物进行两次或一次PCR扩增，经过扩增后得到不同长度的相应基因产物，通过琼脂糖凝胶电泳分析确定不同的基因型。该方法简化了操作步骤，特异性较高，是目前应用比较多的一种适合大样本研究的方法，不足是存在非特异性扩增。

3.5PCR 微板核酸杂交-ELISA法PCR微板核酸杂交-ELISA法是将基因扩增、核酸分子杂交和酶联免疫显色3种技术融为一体，发挥了核酸分子杂交技术特异性高、PCR检测技术灵敏度高和酶联显色检测方便的优点。首先将待测核酸进行PCR扩增，将扩增产物加入预先包被HBV通用探针的微孔板，再加入HBV各基因型显色探针，进行微板核酸杂交，然后通过酶联免疫显色判断结果。该方法耗时短、特异性强、且准确可靠，可用于大规模的HBV分型检测。

3.6线性探针分析(LiPA)基因分型法LiPA基因分型法遵循反向杂交的原理，根据待测序列设计各型特异性线性探针并固化在支持物上，对待测标本特定序列进行PCR扩增，然后将扩增产物与固相探针反向杂交，经显色反应得出结果。该法最大优点是可鉴别用直接测序不能区分的混合型感染。

3.7实时定量 PCR-溶解曲线分析实时定量PCR-溶解曲线分析是将传统PCR检测模式中的PCR扩增和检测相结合，并用溶解曲线分析确定基因型，不同的基因型其目标序列与探针结合时GC含量间的互补性差异导致不同的熔解温度(TM)。该方法快速准确，灵敏度高，可鉴别混合型感染。

3.8限制性片段质谱多态性(RFMP)RFMP以限制性内切酶切割PCR产物，产生型特异性寡核苷酸片段，产生片段的分子量用质谱进行分析。该方法检测限100 copy/mL,灵敏度较高，可以检测突变型和野生型标本，但仪器体积庞大，价格昂贵。

3.9多重PCR多重PCR是在同一PCR反应体系里加入2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析确定其基因型。其经济、快速，可用于大规模研究，可检测混合基因型，但单核苷酸多态性(SNP)酶切位点可影响到方法的灵敏度。

3.10PCR-侵入法PCR-侵入法能检测不同的基因型和亚型，先用多重PCR扩增S序列，然后经过2个侵入反应，第1个侵入反应是将扩增产物与型特异的寡核苷酸初级探针(P1或P2)结合，根据基因型对P1或P2的5′端进行切割，导致5′翼片的释放，在第2个反应中，切割下来的5′翼片能和其通用的FRET盒结合，导致其切割并释放特异性荧光，产生的荧光信号与HBV基因型相对应。该方法有极高的灵敏度，可检测混合基因型，同样SNP酶切位点可影响到方法的灵敏度。

4　乙肝基因型的致病性和治疗反应

研究资料显示，不同基因型/亚型其临床表现不同。日本一项包括585例慢性乙肝患者的研究表明，基因型B较C型进展至肝硬化更缓慢，更早发生HBeAg血清转换和有更少的炎症活动[18]；基因型C和D引起的肝脏疾病比基因型A和B更严重，转化成肝癌的可能性更大。与基因型B相比，基因型C患者HBeAg阳性和HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平、肝脏病理的炎症和纤维化程度均较高；基因型C患者HBeAg更易在年龄偏大时发生血清转换延迟，对干扰素的应答率也较低。顾锡炳等[19]的研究认为C基因型感染者非特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)比B基因型感染者高，非特异性细胞免疫清除HBV的作用相对较弱，在清除HBV的过程中可起肝细胞损伤。这可能是导致C基因型HBV DNA水平、HBeAg阳性率、肝功能损害高于B基因型感染者的原因。美国的研究报道了CHB患者中D基因型更容易导致肝炎的发作，而瑞士的研究显示A基因型较D型更容易慢性化。35岁前B基因型HBV易形成肝细胞癌(HCC)，而50岁以后C型HBV感染者比B基因型更易形成HCC。在所有年龄段内，混合型的病毒载量和HBeAg阳性率最高，提示混合型的HBV感染者较单个基因型感染者更容易形成HCC[20]。一般患者都会合并感染多于2个不同基因型的HBV，例如在亚洲的B和C基因型的合并感染，G基因型引发的慢性感染需要A基因型或H基因型的存在等。

不同基因型的HBV感染者对抗病毒治疗的反应也存在差异。一项台湾的研究报道指出，干扰素治疗后，B基因型的HBeAg血清转换率为41%，而同组中C基因型的转换率仅为15%[21]，且基因型A和B对干扰素为基础的治疗比基因型C和D有更好的反应。B基因型感染的预后一般较好，B基因型HBeAg阳性的CHB患者对IFN-α治疗的应答率高于C基因型，A基因型患者高于D基因型。研究显示B型CHB患者经拉米夫定治疗后HBV DNA阴转率、HBeAg血清转换率及ALT复发率均显著高于B+C及C基因型CHB患者，这可能与C基因型预后不良有关[22]。B1基因亚型的患者比B2基因亚型具有更高的HBeAg阳性率及拉米夫定耐药的发生率。也有研究表明：C2基因亚型比B2基因亚型更易发生拉米夫定耐药，在CHB患者中更明显。目前有感染B2基因亚型的HCC患者术后易复发的报道[23]，提示基因型不仅与HCC的发生有密切关系，同时也影响着肿瘤的复发和转移。当然，有些基因型的临床结果和治疗反应等仍存在争议，如基因型D[24]等，为此还需要做进一步的研究。

5　小　结

全球化和移民人口的增大加快了病毒株之间的分布和重组，如基因型A/D、A/E、C/D、G/C、D/F、A/F等的重组，由于重组导致基因片段在不同的病毒株之间的移动是导致HBV多样性的原因[25]，而移民是全球性HBV分布的混杂因素，大量的移民改变了HBV基因型的分布，导致了越来越多异国株的出现[26-27]。目前HBV基因分类方法尚不完善，本领域的专家开始关心那些新发现的亚型的分类是否准确。Pourkarim等[28]认为分型时应该系统地对病毒基因组进行分析，而不是仅仅对部分序列进行分析。Mahmoud等提出了新术语“recombino-亚型”和“immigro-亚型”；Pourkarim也同时认为，对于重组株没必要给予特定的分型，只需归于重组亚型就好。HBV基因型的分类存在很多复杂因素，对此还需要做更多的研究。

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2016-01-29修回日期：2016-05-06)

云南省应用基础研究计划-昆医联合专项资助项目(2014FB094)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.033

A

1673-4130(2016)15-2136-04