参芎葡萄糖注射液对兔颈动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响

石秀彩，信栓力，孔令恩，宋新星，王利民，史文俊

• 论著 •

参芎葡萄糖注射液对兔颈动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响

石秀彩1，信栓力2，孔令恩1，宋新星1，王利民3，史文俊4

目的 观察参芎葡萄糖注射液对兔颈动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响。方法 选取4月龄健康雄性新西兰兔35只，随机分为空白组、手术组、辛伐他汀组、参芎葡萄糖组、参芎葡萄糖+辛伐他汀组，每组7只。饲养2周后测定血清胆固醇水平，苏木精-伊红染色法（HE）观察血管内膜增生情况，免疫组织化学染色分析血管内膜中膜增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达，Western blot法分析颈动脉葡萄糖调节蛋白78（GRP78）表达。结果 与空白组相比，手术组血清胆固醇水平无明显区别。与空白组、手术组、参芎葡萄糖组相比，辛伐他汀组血清胆固醇水平降低（P＜0.05）。与空白组、手术组相比，参芎葡萄糖组血清胆固醇水平降低（P＞0.05）。参芎葡萄糖+辛伐他汀组血清胆固醇水平低于辛伐他汀组，但无统计学差异（P＞0.05）。HE染色结果表明手术组血管内膜较空白组增厚（P ＜0.05），参芎葡萄糖组血管内膜增生较手术组及辛伐他汀组减少（P＜0.05），参芎葡萄糖+辛伐他汀组血管内膜增生较参芎葡萄糖组减少，但无统计学差异（P＞0.05）。免疫组织化学结果表明参芎葡萄糖组内膜中膜PCNA、MMP9阳性细胞率较手术组均降低（P＜0.05），参芎葡萄糖组MMP9、PCNA阳性细胞率较辛伐他汀组均降低，但无统计学差异（P＞0.05），参芎葡萄糖+辛伐他汀组MMP9、PCNA阳性细胞率较参芎葡萄糖组降低，但无统计学差异（P＞0.05）。Western blot结果表明参芎葡萄糖组GRP78表达量较手术组、辛伐他汀组均降低（P＜0.05）。结论 参芎葡萄糖注射液可有效减缓球囊损伤后血管内膜增生。

参芎葡萄糖注射液；球囊损伤；血管内膜增生

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 清洁级雄性新西兰兔44只（由河北医科大学实验动物中心提供），3月龄，体重2.0～2.5 kg，健康，所选动物符合实验动物质量合格标准。

1.1.2主要材料 血管内膜中膜增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（Abcom，美国）；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抗体（Abcom，美国）；葡萄糖调节蛋白78（GRP78）抗体（Abcom，美国）；PCNA检测试剂盒（中杉金桥，中国），MMP-9抗体免疫组化试剂盒（中杉金桥，中国）。参芎葡萄糖注射液（贵州景峰注射剂有限公司）。

1.2方法

1.2.1建立动物模型 挑选健康新西兰兔，雄性，35只，随机分为5组，每组7只：空白组，仅给予高脂饮食（93%普通饲料+2%胆固醇+5%猪油），无球囊损伤，无药物干预；手术组，给予球囊损伤（图1），并高脂饮食；辛伐他汀组，给予球囊损伤+高脂饮食+辛伐他汀片2.2 mg/ （kg·d）口服；参芎葡萄糖组，给予球囊损伤+高脂饮食+参芎葡萄糖注射液5 ml/（kg·d）腹腔内注射；

参芎葡萄糖+辛伐他汀组，给予球囊损伤+高脂饮食+参芎葡萄糖注射液5 ml/（kg·d）腹腔内注射+辛伐他汀片2.2 mg/（kg·d）口服。以上实验兔适应性喂养1周，空白组对照不做处理，仅高脂喂养2周；其余各组行球囊损伤，后高脂饮食喂养2周。实验兔自由饮水，进食量120～150 g/d。

1.2.2实验取材 处死前于兔耳缘静脉取血2 ml，2500 r/min离心后取上清，于全自动生化仪测定血清胆固醇水平。取血后气体栓塞处死兔子，立即切开颈部，分离并离断球囊损伤处右侧颈总动脉（约0.6 cm），生理盐水冲洗后，每段血管均分为2段，一段放入1.5 ml EP管中，立即放入液氮冷冻，另一段在福尔马林液中固定24 h后进行脱水、透明、浸蜡、包埋。

1.2.3观察血管内膜增生情况 对石蜡进行常规切片病理进行HE染色，于OLYMPUS光学显微镜下观察血管内膜（图1）。

图1　球囊损伤术后7 d、14 d、21 d血管内膜增生情况［A：7 d，B：14 d，C：21 d；（HE染色，×40）］

1.2.4免疫组织化学法测定PCNA、MMP9表达水平 石蜡切片，片厚5μm，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作，用OLYMPUS光学显微镜，随机选取5个不重复高倍镜（×400）视野对PCNA、MMP9阳性细胞计数。

1.2.5Western blot法测定GRP78表达水平 取血管组织于匀浆器中，加入RIPA裂解液400 ul，冰上手动匀浆，直至无肉眼可见组织块，然后超声破碎，每管10 s×3次，冰上操作，12000 r/min，4 ℃，离心10 min，取上清，BCA蛋白定量法测量蛋白浓度，余上清煮沸后分装，配置10%分离胶及5%浓缩胶，每孔上样100 μg蛋白样品，marker上样3 μl，浓缩胶60 V，30 min，分离胶120 V，60 min电泳，随后半干转的方法（20 V，50 min）将蛋白转至NC膜，以5%脱脂奶粉封闭1 h后，并用新鲜配制的 TBST洗膜，每次5 min，洗3次，随后将 NC 膜分别与鼠抗兔 GRP78 抗体（1:1000，Abcam）和鼠抗兔β-actin 抗体（1:1000，Abcam ）条件下孵育过夜。用 TBST 洗膜3次，每次5 min，使用羊抗鼠二抗（1:3000）室温孵育NC膜2 h，配置发光液，均匀滴在NC膜上，凝胶成像分析系统进行灰度扫描分析。

1.3统计学分析 采用SPSS 19.0完成统计，计量数据以（±s）表示，采用完全随机设计的方差分析，组间比较用SNK法作q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2　结果

2.1颈总动脉球囊损伤对新西兰兔颈动脉内膜的影响 石蜡包埋并切片及HE染色后，光镜下观察，空白组颈总动脉管壁光滑、完整，内膜、中膜界限清晰，未见明显内膜增生（图2A）。手术组则可见大量的新生内膜（图2B），辛伐他汀组、参芎葡萄糖组及参芎葡萄糖+辛伐他汀组内膜增生情况较手术组明显降低（图2C、D、E）。手术组的内膜面积（NIA）和中膜面积（MIA）比值较空白组显著增加（P＜0.05），而辛伐他汀组、参芎葡萄糖组及参芎葡萄糖+辛伐他汀组NIA/MIA小于手术组NIA/MIA（P ＜0.05），其中，参芎葡萄糖组NIA/MIA小于辛伐他汀组NIA/MIA（P＜0.05），参芎葡萄糖+辛伐他汀组NIA/MIA小于参芎葡萄糖组NIA/MIA，但无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.2新西兰兔血清中血清胆固醇水平的比较 从兔耳缘静脉抽血后，于生化分析仪上测定血清中血清胆固醇水平，结果显示，空白组与手术组两者间血清胆固醇水平无明显区别，辛伐他汀组血清胆固醇水平明显低于参芎葡萄糖组及空白组与手术组（P＜0.05），参芎葡萄糖组的血清胆固醇水平低于空白组及手术组，但这两者之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。参芎葡萄糖+辛伐他汀组血清胆固醇水平低于辛伐他汀组，但无统计学差异（P＞0.05）（图3）。

图2　药物干预后血管内膜增生情况［A：空白组；B：手术组；C：辛伐他汀组；D：参芎葡萄糖组；E：参芎葡萄糖+辛伐他汀组（HE染色，×200）］

2.3新西兰兔颈动脉内膜中PCNA及MMP-9的表达变化 光镜下观察，PCNA、MMP9免疫组化阳性的细胞为棕色，空白组中阳性细胞少，而手术组、辛伐他汀组、参芎葡萄糖组则可见血管内膜、中膜上有大量阳性细胞（图4、5），参芎葡萄糖组与手术组相比，阳性细胞明显减少（P ＜0.05）。参芎葡萄糖组MMP9及PCNA表达率低于辛伐他汀组，但无统计学意义（P＞0.05）。参芎葡萄糖+辛伐他汀组MMP9及PCNA表达率低于参芎葡萄糖组，但无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.4新西兰兔颈动脉中GRP78表达变化 提取血管组织蛋白，通过Western blot法观察GRP78表达水平（图6、7）。结果表明：参芎葡萄糖组GRP78表达水平明显低于手术组及辛伐他汀组（P＜0.05）。参芎葡萄糖+辛伐他汀组GRP78表达水平与参芎葡萄糖组相比无明显区别，参芎葡萄糖+辛伐他汀组GRP78表达水平明显低于辛伐他汀组（P＜0.05）。

3　讨论

血管内膜增生机制非常复杂，目前研究认为损伤、血管平滑肌细胞（VSMC）向内膜迁移、增殖等多种因素均参与了血管内膜增生。近年来，从中药中寻找抗血管内膜增生及探讨可能的机制已成为这一研究领域的热点。传统中药丹参素及川芎嗪具有广泛的药理作用。前期研究表明参芎葡萄糖有清除自由基、阻断脂质过氧化、抑制细胞增殖的作用。本实验探讨参芎葡萄糖对球囊损伤所致新西兰兔颈总动脉内膜增生的抑制效应。

本实验采取高脂喂养新西兰兔及球囊损伤颈总动脉的方法，建立动物模型，通过HE染色从组织学水平观察球囊损伤后颈总动脉内膜面积及中膜面积的变化，结果表明，辛伐他汀及参芎葡萄糖均可减低血管内膜的增生，与辛伐他汀相比，参芎葡萄糖可明显减少血管内膜面积的增加，参芎葡萄糖+辛伐他汀联合治疗同样可抑制血管内膜增生，但与单用参芎葡萄糖相比无统计学差异。

脂质代谢异常在血管内膜增生过程中有重要作用，通过本实验，我们发现辛伐他汀可减低血清中胆固醇及低密度脂蛋白的水平，与不用药物干预组、参芎组相比有统计学意义。参芎葡萄糖虽然也可以降低血清中胆固醇及低密度脂蛋白水平，但与不用药物干预组相比无统计学意义。参芎和辛伐他汀联合治疗可降低实验兔血清中胆固醇水平，但与单用辛伐他汀相比，无明显差别。

表1　各组大鼠间NIA/MIA值、PCNA表达水平及PMMP-9表达水平

图3　各组大鼠血清胆固醇水平（与空白组比较，aP＜0.05；与手术组比较，bP＜0.05；与辛伐他汀组比较，cP＜0.05；与参芎葡萄糖组比较，dP＜0.05）

图4　PCNA表达情况（A：空白组；B：手术组；C：辛伐他汀组；D：参芎葡萄糖组；E：参芎葡萄糖+辛伐他汀组； S-P法，×400 ）

图5　各组间MMP-9表达水平的免疫组化检测（A：空白组；B：手术组；C：辛伐他汀组；D：参芎葡萄糖组；E：参芎葡萄糖+辛伐他汀组；S-P法，×400）

图6　GRP78表达的western blot分析

图7　GRP78表达水平（与空白组比较，aP＜0.05；与手术组比较，bP ＜0.05；与辛伐他汀组比较，cP＜0.05）

为了进一步探讨参芎葡萄糖及辛伐他汀调控血管内膜增生的机制，通过免疫组化的方法测定了血管内PCNA、MMP9的表达水平。PCNA仅表达于增殖过程中的细胞，表达的高低与增殖活性相关，通过测定PCNA表达，可评价细胞增殖状态。MMP9可降解细胞外基质，为血管平滑肌细胞穿过基底膜向内膜迁移提供条件，促进内膜新生。本实验表明，辛伐他汀与参芎葡萄糖均可减低PCNA、MMP9的表达，但两者间无统计学差异，提示参芎葡萄糖及辛伐他汀可能通过抑制细胞增殖及阻碍血管平滑肌迁移调控内膜增生。两者联合用药与单独用药相比，PCNA、MMP9的表达的影响无统计学差异。

本实验在5 ml/（kg·d）的参芎葡萄糖注射液与2.2 mg/（kg·d）的辛伐他汀给药的条件下，两者调控PCNA、MMP9表达的能力无明显差异，但参芎葡萄糖抑制血管内膜增生（H-E染色光镜下观察内膜面积的明显差异性）的效果强于辛伐他汀，提示参芎葡萄糖可能通过其他途径调控内膜增生。

近年来内质网应激（ERS）为研究热点，众多生理病理过程中ERS均参与其中，研究表明，抑制内质网应激可有效改善内膜增生导致的血管狭窄，GRP78属于热休克蛋白Hsp70亚家族。该亚家族还包括mtHsp70/GRP75和GRP94。BiP/ GRP78是一种钙离子结合分子伴侣，主要定位于内质网。GRP78蛋白上调被认为是ERS的重要指标。WB结果提示与辛伐他汀相比，参芎葡萄糖可明显抑制GRP78的表达（P＜0.05），可明显抑制GRP78的表达（P＜0.05），因此参芎葡萄糖可明显抑制高脂饮食条件下新西兰兔颈动脉损伤后血管内膜的增生，其主要可能的机制为抑制ERS调控血管内膜增生。

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本文编辑：芦洁，田国祥

Effect of shenxiong glucose injection on intimal hyperplasia of rabbit vascular after carotid artery balloon injury

SHI Xiu-cai*， XIN Shuan-li， KONG Ling-en， SONG Xin-xing， WANG Li-min， SHI Wen-jun.*Department of Cardiology，The PLA 285th hospital， Handan， Hebei， 056002， China.

XIN Shuan-li， E-mail: xinkexuan@163.com

Objective To observe the effect of shenxiong glucose injection on intimal hyperplasia of rabbit vascular after carotid artery balloon injury. Methods 35 four months old healthy male New Zealand rabbits were randomly divided into control group， operation group， simvastatin group， shenxiong glucose group， shenxiong glucose+ simvastatin group. Each group had 7 rabbits. Two weeks after operation and drug intervention， serum cholesterol level were measured. Hematoxylin and eosin staining （HE） was used to observe intimal hyperplasia；immunohistochemical staining was used to analyze intimal proliferation cell nuclear antigen （PCNA） and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） expression， Western blot was used to analyze carotid glucose-regulated protein 78 （GRP78） expression. Results There was no different in serum cholesterol levels between operation group and control group. Serum cholesterol levels of simvastatin group was lower than control group， operation group and shenxiong glucose group （P《0.05）. Serum cholesterol levels of shenxiong glucose group was lower than control group and operation group （P《0.05）. Serum cholesterol levels of shenxiong glucose+ simvastatin group was lower than simvastatin group with no significant difference （P＞0.05）. HE result showed that intima of operation group was thicker than control group （P《0.05）； intima hyperplasia of shenxiong glucose group was reduced than operation group and simvastatin group （P＞0.05）； intima hyperplasia of shenxiong glucose+ simvastatin group was reduced than shenxiong glucose group with no significant difference （P＞0.05）. Immunohistochemical analysis results showed that PCNA， MMP9 positive cells in shenxiong glucose group was reduced than operation group （P《0.05）； PCNA， MMP9 positive cells in shenxiong glucose group was reduced than simvastatin group with no significant difference （P＞0.05）；PCNA， MMP9 positive cells in shenxiong glucose+ simvastatin group was reduced than shenxiong glucose group with no significant difference （P＞0.05）. GRP78 expression in shenxiong glucose group was reduced than operation group and simvastatin group according to result of Western blot （P《0.05）. Conclusion The Shenxiong glucose can effectively reduce neointimal hyperplasia after balloon injury.

Shenxiong glucose injection； Balloon endothelial injury； Intimal hyperplasia

R543

A

1674-4055（2016）05-0619-05

1056002 邯郸，解放军第285医院心内科；2056002 邯郸，邯郸市第一医院心内科；3056002 邯郸，邯郸丛台区卫生监督局；4056002邯郸，解放军第285医院检验科

信栓力，E-mail:xinkexuan@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.05.33

目前国内已经广泛开展了介入手术治疗冠心病及外周血管疾病，但血管成形术术后血管再狭窄严重限制了介入治疗的远期疗效。虽然通过置入药物洗脱支架可有效的降低术后再狭窄率，但药物洗脱支架多应用于冠状动脉疾病，且其成本高，大大增加患者经济负担。血管再狭窄的特征为血管内膜增生，其发病机制十分复杂，目前大量试验研究表明血管内膜新生、血管重塑、内皮细胞激活、血管平滑肌迁徙增殖、血小板聚集、炎症反应与血管内膜增生相关［1-4］。有相关研究表明内膜损伤后，血小板可在局部粘附、聚集，形成血栓并且激活血小板，释放血小板衍生生长因子（PDGF）等血管活性物质，促进了血管平滑肌细胞的增殖［5-8］。参芎葡萄糖注射液为含有丹参素及川芎嗪的输液剂型，其中丹参素具有一定的降脂作用，可减低外周血管阻力，降低血液中的粘滞度，抑制血小板聚集，川芎嗪是一种重要活性碱，可降低血管外周阻力，研究表明参芎葡萄糖注射液可改善脂质代谢，调节血液流变性异常，减轻炎症反应等［9］。本研究通过建立高脂饮食及球囊损伤条件下兔颈总动脉血管内膜增生模型，以参芎葡萄糖注射液为干预，观察参芎葡萄糖对兔颈总动脉内膜增生的影响及探讨可能的机制，为预防介入术后血管再狭窄提供新思路。