小青龙汤对慢性肾炎寒饮蕴肺证大鼠模型的药效学研究

王　浩，李泽庚，黄平富，童佳兵，赵志奋，杨　程

(1. 滁州市中西医结合医院，安徽 滁州　239000；2. 安徽中医药大学，安徽 合肥　230012；3. 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥　230031)



·实验研究·

小青龙汤对慢性肾炎寒饮蕴肺证大鼠模型的药效学研究

王浩1，李泽庚2，黄平富1，童佳兵3，赵志奋1，杨程3

(1. 滁州市中西医结合医院，安徽 滁州239000；2. 安徽中医药大学，安徽 合肥230012；3. 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031)

[摘要]目的观察小青龙汤对慢性肾炎寒饮蕴肺证大鼠相关实验室指标的影响。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组和小青龙汤组，每组20只。采用强迫大鼠在冷水中疲劳游泳和腹腔注射小牛血清白蛋白的方式复制慢性肾炎寒饮蕴肺证模型。观察3组大鼠一般情况；实验第6、7、8周时连续检测24 h尿蛋白；实验第8周时，检测尿表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清白蛋白(albumin, ALB)、血清总胆固醇(total cholesterol, TC)水平；光镜下观察大鼠肾组织形态学变化。结果小青龙汤可改善模型大鼠的一般状况。实验第6、7、8周时，小青龙汤可明显降低模型大鼠升高的24 h尿蛋白含量(P<0.05)；实验第8周时，小青龙汤可明显降低模型大鼠升高的尿EGF、SCr、BUN和血清TC水平(P<0.05)，明显升高模型大鼠降低的血清ALB水平。光镜下显示，小青龙汤可防止肾小球体积增大和系膜细胞增多，防止肾小管上皮细胞肿胀。结论小青龙汤具有降低慢性肾炎寒饮蕴肺证大鼠尿蛋白水平，保护肾功能和防止肾组织病理变化的作用。

[关键词]慢性肾炎；宣肺利水法；小青龙汤

慢性肾小球肾炎简称慢性肾炎，临床多以蛋白尿、水肿、肾功能不全为特征。肺主宣发，水液随其鼓舞而上行头面，外达肌腠；肺主肃降，水液在其约束而下注肾与膀胱；肺通过宣发和肃降功能来推动和调节全身水液的输布和代谢。这是宣肺利水法治疗慢性肾炎的中医整体观念、“病在下，治其上”治疗原则的体现。本研究通过复制病证结合的动物模型，运用具有宣肺利水作用的小青龙汤干预慢性肾炎模型大鼠，并观察主要药效学指标的变化，为小青龙汤防治慢性肾炎提供实验依据。

1　材料

1.1实验动物清洁级健康雄性Wistar大鼠60只，生产许可证号为SCXK(皖)2011-002，体质量250～300 g，由安徽省实验动物中心提供。将其随机分为正常组、模型组与小青龙汤组3组，每组20只。动物饲养室为清洁级，于独立送风隔离笼具(康为IR60)饲养，笼内温度控制在(20±1)℃，相对湿度60%。自然光照，塑料笼内以消毒木屑为垫料，食水自取。

1.2主要试剂与药物

1.2.1试剂2%戊巴比妥；弗氏不完全佐剂：美国Sigma公司，批号 F5506；小牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)：购自博世德生物制品有限责任公司，批号为PR0025-3；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)：购自北京朋利驰科技有限公司，批号为10010-023)。

1.2.2药物小青龙汤(麻黄、半夏、白芍各9 g，炙甘草、桂枝各6 g，干姜、细辛、五味子各3 g)：由安徽中医药大学第一附属医院提供，配成浓度为0.056 g/mL的溶液。

1.3主要仪器动物强迫游泳装置：安徽中医药大学第一附属医院研制；RM2135型石蜡切片机：斯沃德仪器设备有限公司；EG1160型包埋机：上海仪器有限公司；QP-B型切片漂烘温控仪：安徽电力科学研究所；CX41-12C02型光学显微镜：日本OLYMPUS；HH-W21-600型37 ℃电热恒温水温箱：上海医用恒温设备厂；A1830208型自动匀浆机：上海艾测电子科技有限公司。

2　方法

2.1慢性肾炎寒饮蕴肺证模型的复制将大鼠适应饲养1周后，第2周开始，参照杨丽平等[1]、孙广仁等[2]的方法，将大鼠在5 ℃左右水中每天游泳30 min，使其劳累，再将大鼠置于独立送风隔离笼具，保持笼内温度为(5±1)℃，相对湿度为60%，使其感受寒邪，共3周，复制“寒饮蕴肺证”模型。从第5周开始，对大鼠进行预免疫，每周3次，即取BSA 100 mg溶于1% PBS溶液3.75 mL中，加弗氏不完全佐剂，混匀成30 mL混悬液，超声乳化，在大鼠两腹股沟、两前足跖，共4点做皮下注射，每点0.05 mL，同时腹腔注射0.2 mL，正常组用生理盐水与弗氏不完全佐剂按相同比例乳化行皮下注射。第6周对大鼠进行正式免疫，在大鼠腹股沟皮下注射0.05 mL BSA混悬液，隔日1次，共2周。预免疫和正式免疫用于复制慢性肾炎模型。

2.2给药方法 从第6周开始，小青龙汤组大鼠每日接受小青龙汤10 mL/kg(相当成人临床用量)灌胃，正常组与模型组大鼠接受2.5 mL等容量生理盐水灌胃，共2周。

2.3指标观察方法

2.3.1一般情况观察观察大鼠饮食量、饮水量和运动情况，以及毛色有无光泽，尿道口是否红肿，皮下有没有水肿，眼睑是否浮肿。

2.3.224 h尿蛋白及尿表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)检测各组分别在第6周、第7周及第8周用代谢笼收集24 h尿液，用浊度法定量测24 h尿蛋白，用放射免疫法测定尿液中EGF水平。

2.3.3血生化指标检测用多功能全生化分析仪测定血清肌酐(serum creatinine, SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血清白蛋白(albumin, ALB)、血清总胆固醇(total cholesterol, TC)。至第8周时，按1 mL/kg剂量对大鼠腹腔注射2%戊巴比妥，将大鼠麻醉后，从腹主动脉取血，室温放置2 h后，3 000 r/min离心20 min，取上清液，待用。

2.3.4肾组织形态学观察腹主动脉采血后，将大鼠处死，取肾组织，置于4%多聚甲醛中固定，8 h后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(6 μm)，作苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，OLYMPUS显微镜观察HE染色切片并摄片。

3　结果

3.1一般状况观察在模型复制和灌胃过程中，正常组也进行了干预，死亡4只；模型组与小青龙汤组分别死亡6只和8只。从剩余大鼠中随机取10只进行试验。与正常组比较，模型组大鼠饮食量、饮水量减少且活动缓慢，毛色欠光泽，尿道口有红肿，皮下轻度水肿，眼睑可见浮肿。小青龙汤组与正常组一般情况差异无统计学意义。

3.23组大鼠24 h尿蛋白、尿EGF水平比较两因素混合设计的不等距重复测量数据的方差分析结果显示，被试内因素(时间)和被试间因素(组别)对慢性肾炎大鼠24 h尿蛋白水平的主效应具有统计学意义(被试内因素：F(3，81)=503.12，P=0.000；被试间因素：F(2，27)=3 206.78，P=0.000)，两者的交互作用也具有统计学意义(F(6，81)=491.45，P=0.000)。简单效应分析结果显示，给药前3组尿蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；实验第6、7、8周，模型组大鼠24 h尿蛋白水平显著高于正常组和小青龙汤组(P<0.05)；模型组大鼠各时点24 h尿蛋白水平比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；正常组大鼠各时点24 h尿蛋白水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较，模型组尿EGF水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，小青龙汤组尿EGF水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1　3组大鼠24 h尿蛋白和尿EGF水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.33组血生化指标测定与正常组比较，模型组SCr、TC和BUN水平显著升高(P<0.05)，ALB含量显著下降(P<0.05)。与模型组比较，小青龙汤组血清TC和BUN水平显著降低(P<0.05)，ALB显著升高(P<0.05)。见表2。

3.43组大鼠肾组织的形态学观察HE染色结果如图1所示，正常组大鼠肾脏组织中肾小球、肾小管基本结构和形态均未见异常。与正常组比较，模型组大鼠肾组织均发生不同程度的病理变化，模型组大鼠肾小球体积均有不同程度的增大，系膜细胞有不同程度的增多，肾小管上皮细胞有不同程度的肿胀，局部肾小管近曲小管上皮细胞未见刷状缘；但未见肾间质纤维化。小青龙汤干预后肾小球体积稍增大，系膜细胞少量增多。局部肾小管近曲小管上皮细胞刷状缘未见明显异常。

表2　 3组大鼠SCr、BUN、ALB和TC水平比较

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图1　 各组大鼠肾小球和肾小管的形态学观察(HE染色，10×40倍)

4　讨论

以中医理论为指导，参照西医经典的模型复制方法，让大鼠感受风、寒、湿邪，邪乘虚入里，内扰脾肾之阳，致脾失健运、肾失开阖、气机阻滞、水湿内停，从而出现下肢及全身浮肿，即为溢饮。本研究利用BSA可以提高等电点，通过肾小球基底膜表面负电荷屏障种植于基底膜上的特点，复制原位免疫复合物性肾炎，其发病机制及病理改变均类似于人类膜性肾病[3]。与正常组比较，模型组在实验第6、7、8周时24 h尿蛋白显著升高(P<0.05)，呈现持续性蛋白尿，提示肾脏发生了病变。且模型组ALB含量较正常组显著降低(P<0.05)。EGF含量可作为判断慢性肾炎肾组织损伤和纤维化的指标之一[4]，模型组尿EGF水平显著高于正常组(P<0.05)，SCr水平变化主要由肾小球的滤过能力来决定[5]。SCr水平高出正常值多提示肾脏受损，肾功能不全时，SCr在体内蓄积成为对人体有害的毒素。与SCr一样，在肾功能损害早期，BUN可在正常范围。当肾小球滤过率下降到正常值的50%以下时，BUN浓度才迅速升高[6-7]。本研究表明，与正常组比较，模型组SCr和BUN水平均显著升高(P<0.05)，且肾小球、肾小管也发生病理性改变；同时，模型组TC浓度也显著升高(P<0.05)。以上结果提示大鼠出现了类似慢性肾炎寒饮蕴肺证的变化。

肺金为肾水之母，子之病可从母治之。肺主通调水道，为水之上源。水液的输布代谢有赖于肺的宣降，肺主宣发，水液随其鼓舞而上行头面，外达肌腠；肺主肃降，水液在其约束而下注肾与膀胱[8]。肺失治节，津液不能宣发从汗而解，亦不能肃降气化为尿液。气机失调，精微不升则发生蛋白尿或血尿。大鼠在冷水中游泳，劳则气耗，肺气亏虚，卫外功能减弱，易感受寒邪或寒邪直中少阴，肾阳受损，温煦功能降低[9]。慢性肾炎属于中医“痰饮”“水肿”范畴，其治疗以发汗、利尿为原则。《金匮要略》曰：“诸有水者，腰以下肿，当利小便，腰以上肿，当发汗乃愈。”“病痰饮者，当以温药和之。”即在治疗痰饮病时，应注意选用温性药物[10]。“病溢饮者，当发其汗，大青龙汤主之，小青龙汤亦主之”(《金匮要略》)。大青龙汤主治外感风寒兼有里热，然小青龙汤为外有风寒内有水饮而设，结合治疗痰饮的法则，故适宜选用小青龙汤。其中麻黄与桂枝相须为君，麻黄得桂枝相助，发汗散寒解表邪，同时桂枝温阳化气，与麻黄协同作用，加强利尿之功。细辛与干姜辛温，为臣药，助麻黄、桂枝解表，能温肾而行水。《素问·藏气法时论》曰：“肾苦燥，急食辛以润之，开腠理，致津液，通气也。”细辛又为少阴肾经表药[11]。辛温发散恐耗散肺气，故佐以酸寒之芍药和酸温之五味子以收之。《素问·藏气法时论》曰：“肺欲收，急食酸以收之。”半夏辛温，能收逆气而散水饮，为使药。炙甘草可益气和中，又可调和辛散酸收之品，为佐使之药。

与模型组比较，小青龙汤组在实验第6、7、8周时尿蛋白均明显降低(P<0.05)；实验第8周时，小青龙汤组尿EGF明显降低(P<0.05)，SCr、BUN和血清TC含量也显著下降(P<0.05)，血清ALB含量明显上升(P<0.05)，肾小管和肾小球病理变化均明显改善。结果提示小青龙汤对慢性肾炎寒饮蕴肺证具有较好的疗效。

参考文献：

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基金项目：国家自然科学基金项目(81001520)

作者简介：王浩(1986-)，男，医师

通信作者：李泽庚，li6609@126.com

[中图分类号]R692.3；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.018

(收稿日期：2015-12-13；编辑：姚实林)

Pharmacodynamics of Xiaoqinglong Decoction in Rat Model of Chronic Nephritis with Syndrome of Cold Fluid Retention in Lung

WANGHao1,LIZe-geng2,HUANGPing-fu1,TONGJia-bing3,ZHAOZhi-fen1,YANGCheng3

(1.ChuzhouIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicalHospital,AnhuiChuzhou239000,China; 2.AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of Xiaoqinglong Decoction on related experimental indexes in rats with chronic nephritis with the syndrome of cold fluid retention in lung. MethodsA total of 60 Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, and Xiaoqinglong Decoction group, with 20 rats in each group. The rats were forced to swim to fatigue in cold water and were given intraperitoneal injection of bovine serum albumin to establish the model of chronic nephritis with the syndrome of cold fluid retention in lung. The rats’ general status was observed. At weeks 6, 7, and 8 of the experiment, 24-h urinary protein excretion was measured continuously; at week 8 of the experiment, the levels of urinary epidermal growth factor (EGF), serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), serum albumin (Alb), serum total cholesterol (TC) were measured. The morphological changes in renal tissue were observed under a light microscope. ResultsXiaoqinglong Decoction improved the rats’ general status. At weeks 6, 7, and 8 of the experiment, the Xiaoqinglong Decoction group showed a significant reduction in the elevated 24-h urinary protein excretion (P<0.05); at week 8 of the experiment, the Xiaoqinglong Decoction group showed significant reductions in the elevated levels of urinary EGF, SCr, BUN, and serum TC (P<0.05), as well as a significant increase in the reduced serum ALb level. As was shown by the light microscope, Xiaoqinglong Decoction prevented the increases in the glomerular volume and the number of mesangial cells, as well as the swelling of renal tubular epithelial cells. ConclusionIn rats with chronic nephritis with the syndrome of cold fluid retention in lung, Xiaoqinglong Decoction can reduce the level of urinary protein, protect renal function, and prevent renal histopathological changes.

[Key words]Chronic nephritis; Method of freeing lung-qi and eliminating damp; Xiaoqinglong Decoction