电针“肺俞”穴对慢性阻塞性肺疾病大鼠迷走神经放电的影响

刘小云，李　路，李庚儒，舒　琦，丰丽媛，林先刚，徐亚静，刘自兵,3

(1.安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽 合肥　230038；2.安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽 合肥　230038；3.安徽中医药大学针灸经络研究所，安徽 合肥　230038)



·针灸经络·

电针“肺俞”穴对慢性阻塞性肺疾病大鼠迷走神经放电的影响

刘小云1，李路1，李庚儒2，舒琦1，丰丽媛1，林先刚1，徐亚静1，刘自兵1,3

(1.安徽中医药大学针灸骨伤临床学院，安徽 合肥230038；2.安徽中医药大学中西医结合临床学院，安徽 合肥230038；3.安徽中医药大学针灸经络研究所，安徽 合肥230038)

[摘要]目的观察电针“肺俞”穴对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)大鼠迷走神经放电的影响，初步探讨针刺治疗COPD的作用机制。方法随机将40只SD大鼠分为正常组、正常电针组、模型组、模型电针组，后两组以香烟烟熏结合脂多糖气管滴注法复制COPD模型。观察各组大鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和血浆中乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的含量，并取正常电针组、模型电针组大鼠的“肺俞”穴进行即刻电针治疗，观察电针前后大鼠迷走神经放电情况。结果与电针前比较，正常电针组和模型电针组大鼠电针后颈部左侧迷走神经放电频率、面积和幅度均显著增加(P<0.05)，模型电针组大鼠电针前后颈部左侧迷走神经放电频率、面积和幅度差值显著大于正常电针组(P<0.05)。ACh在外周血浆中含量变化为：模型组显著高于正常组(P<0.05)，模型电针组显著高于正常电针组但显著低于模型组(P<0.05)。ACh在BALF中含量变化为：正常电针组显著高于正常组(P<0.05)，模型电针组显著高于正常电针组和模型组(P<0.05)。结论电针“肺俞”穴可使COPD大鼠迷走神经放电增强，并促进肺局部ACh递质的释放。

[关键词]慢性阻塞性肺疾病；电针；肺俞；迷走神经；乙酰胆碱

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见的慢性气道炎性疾病，以不完全可逆的气流受限为特点，气流受限呈进行性加重，与肺部对香烟烟雾等有害气体或颗粒的异常炎症反应有关[1]。其因患病率高、渐进性发展、病死率高、经济负担重等特点成为严重的公共卫生问题之一[2]。作为当今临床中较为难治的一种呼吸系统疾病，亟需寻找出可行有效的治疗方法。针刺疗法是中医学的优势和特色，在对COPD的治疗中早有应用，其中“肺俞”穴为临床治疗COPD使用频次最高的穴位[3]。近年来有研究发现针刺的抗炎作用与胆碱能抗炎通路存在密切联系[4]，这条抗炎途径以迷走神经、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)及其特异性受体为基础，在调控炎症方面具有迅速、直接、高效的特点[5]。本实验以迷走神经为切入点，观察电针“肺俞”穴对COPD大鼠迷走神经放电的影响及其神经递质ACh含量的变化，旨在阐释针刺干预COPD的作用机制，为针刺防治COPD提供实验依据。

1　材料

1.1实验动物及分组清洁级SD雄性大鼠40只，体质量为250～300 g，由江苏省常州卡文斯实验动物有限公司提供，生产许可证号为SCXK(苏)2011-0003。动物于室温环境下适应性饲养1周后，被随机分为正常组(未经处理的空白大鼠)、正常电针组(空白大鼠+电针“肺俞”穴)、模型组(COPD模型大鼠)、模型电针组(COPD模型大鼠+电针“肺俞”穴)，每组10只。

1.2实验材料及仪器红三环香烟(安徽中烟工业有限责任公司产品；焦油含量8 mg，烟气烟碱含量0.4 mg，二氧化碳含量13 mg)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)：Sigma公司产品，批号 20150305；大鼠ACh酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)试剂盒：R&D公司，批号 E-30165；混合麻醉药：由α-氯醛糖(德国默克公司生产，批号 52408)、乌拉坦(上海强顺化学试剂有限公司，批号 20090406)和硼砂(江苏省扬州沪宝化学试剂有限公司，批号 20090103)组成；RT-6000型酶标仪：雷杜生命科学股份有限公司。BL-420S型生物机能采集系统：四川省成都泰盟科技公司；华佗牌SDZ-Ⅴ型多功能电针治疗仪：江苏省苏州医疗用品厂。

2　方法

2.1COPD动物模型复制利用香烟熏吸加气管滴注LPS复制COPD大鼠模型[6]。大鼠于第1天、第14天向气管内注入LPS 1 mg/kg。第2天将大鼠置入1 m3自制烟熏箱内，以红三环香烟每日烟熏1 h，持续1个月。

2.2迷走神经放电记录以7 mL/kg剂量的混合麻醉药对大鼠进行麻醉，钝性分离大鼠颈部左侧迷走神经，用周边肌肉和皮肤做好皮兜，充以预热37 ℃的石蜡油，给予迷走神经保护，将迷走神经勾挂于氯化银电极(直径0.7 mm，电阻小于1 Ω，四川省成都泰盟科技公司)上，连接导线至生物功能采集系统，打开软件，进行迷走神经放电原始信号记录，采集指标为放电频率、面积和幅度。

2.3穴位即刻电针刺激大鼠仰卧位于自制的镂空网格的鼠板上，取大鼠背部双侧“肺俞”穴(第2胸椎棘突最高点作为标志，向下顺摸第3胸椎棘突下旁开7 mm[7])，将直径0.25 mm、长13 mm的一次性无菌针灸针刺入穴位，针柄以导线连接多功能电针治疗仪，参数采用4/20 Hz频率，电流2 mA，以引起大鼠背部皮肤轻微抖动为宜，针刺持续30 min，电针后记录大鼠迷走神经放电情况。

2.4取材血浆采集：电生理记录完成后，采集大鼠腹主动脉血5 mL，置于肝素抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清。支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)的抽取：采血后，开胸，充分暴露肺脏，用注射器插入气管插管上端，取6 mL生理盐水反复3次灌洗支气管及肺泡，回抽灌洗液置于离心管，按上述方法离心。所得血浆及BALF于-20 ℃存放。

2.5ACh含量检测参照ELISA试剂盒说明书操作，主要包含以下步骤：①包被抗原；②加封闭液；③加被检血浆；④加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG；⑤加底物；⑥加终止液；⑦用酶标仪记录490 nm读数。

3　结果

3.1电针“肺俞”穴对各组大鼠颈部左侧迷走神经放电频率、面积、幅度的影响与电针前比较，正常电针组和模型电针组大鼠电针后颈部左侧迷走神经放电频率、面积和幅度均显著增加(P<0.05)，模型电针组大鼠电针前后颈部左侧迷走神经放电频率、面积和幅度差值显著大于正常电针组(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠电针前后颈部左侧迷走神经放电频率、面积和幅度比较±s)

注：与同组电针前比较，*P<0.05；与正常电针组比较，#P<0.05。

3.2各组大鼠ACh含量的变化含有一个重复测量数据的三因素方差分析结果显示，检测部位因素、模型因素和电针因素对ACh水平的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，检测部位、模型因素和电针因素的交互作用也具有统计学意义(P<0.05)，见表2和表3，故以简单效应分析为主。模型组血浆ACh水平和正常电针组BALF中ACh水平显著高于正常组(P<0.05)，模型电针组BALF中ACh水平显著高于模型组和正常电针组(P<0.05)，模型电针组血浆ACh水平显著高于正常电针组(P<0.05)，但显著低于模型组(P<0.05)，见表4。结果表明，电针“肺俞”穴可增加BALF中ACh含量而降低血浆ACh含量；电针“肺俞”穴对COPD病理状态下大鼠ACh合成、释放的调节作用更明显。

表2　模型因素和电针因素对血浆和BALF中ACh水平影响的方差分析结果(被试内因素分析)

表3　模型因素和电针因素对血浆和BALF中ACh水平影响的方差分析结果(被试间因素分析)

表4　各组大鼠血浆和BALF中ACh水平比较

注：与正常组比较，△P<0.05；与正常电针组比较，*P<0.05；与模型组比较，◇P<0.05。

4　讨论

迷走神经是混合型脑神经(第Ⅹ对脑神经)，行程长，分布范围广。在生理状态下，迷走神经调节气道张力、血液供应、黏液分泌及呼吸形式等。迷走神经兴奋时，可导致气管平滑肌收缩[8]。但近年来也有研究发现，迷走神经传出纤维具有抗炎作用，可以降低局部炎性反应，实现对炎症的调控[9]。

近年来，针刺和迷走神经的关系是研究的热点。叶小丰等[10]通过电针“足三里”穴发现，迷走神经传出纤维放电增加。但若双侧腹腔迷走神经预先被切断，电针足三里对迷走神经的干预作用将明显减弱或消失[11]。刘丽芝等[12]发现针刺“神门”穴可使迷走神经兴奋，增强自主神经的整合功能，减缓心率。而在本实验中对电针的即刻效应的观察，发现电针“肺俞”穴也可使大鼠迷走神经放电增强。电针“肺俞”穴后正常组和模型组大鼠迷走神经放电的频率、面积、幅度均有增长，且模型组更甚。表明电针“肺俞”穴可激活迷走神经，且在COPD状态下其效应更明显。罗丽平等[13]观察电针对心脏自主神经调节的即刻效应和后效应中，发现即刻调节作用是以迷走神经兴奋为主，但取针后心迷走和心交感神经张力变化不显著。而电针则引起交感神经、迷走神经兴奋，取针后心交感神经兴奋占主导。本实验已观察到电针有兴奋迷走神经的即刻效应，但电针是否也兴奋交感神经，使两者在对支气管平滑肌的调节上达到新的动态平衡，尚需进一步研究。

课题组前期实验已发现，针刺治疗可以减轻COPD模型大鼠病理特征和改善肺通气功能[14]，针刺“足三里”穴可以下调肺组织白细胞介素-1β及血浆白细胞介素-6的含量，抑制肺组织炎性反应[15]。推测电针“肺俞”穴兴奋迷走神经，促进ACh合成、释放，与电针抗炎反应有关。2000年，Borovikova提出“胆碱能抗炎通路”的概念[16]，即迷走神经及其递质可抑制巨噬细胞的活化，在抗炎反应过程中有重要作用。关于激活迷走神经，促进递质合成、释放并参与抗炎治疗疾病的研究被人们广泛关注。2015年有研究发现，在刺激犬右侧迷走神经干后，其心肌缺血再灌注损伤降低，机制为通过激活迷走神经的胆碱能抗炎通路，抑制全身和局部的炎性反应[17]。已有实验证明，电刺激迷走神经可明显改善肺组织的通气功能，减轻感染性休克时肺组织的损伤，具有潜在的保护肺脏的作用[18]。本实验也发现正常和模型大鼠经电针后BALF中ACh含量均明显升高，与迷走神经放电增强的结果一致。但电针兴奋迷走神经活动、增加ACh释放的作用是否在短时间能改善肺局部应激或炎症环境尚缺乏直接证据。另外，实验中还发现，在外周血浆中，模型大鼠比正常大鼠ACh含量增高，而正常大鼠和模型大鼠电针后ACh含量均有降低。已有研究发现，ACh能在人全血中抑制LPS所诱导的炎性递质的释放[19]。本实验模型大鼠ACh含量增高，推测可能与其在病理状态下的代偿性增高并参与抑制炎症有关，鉴于ACh在全身及局部的复杂功能，对即刻针刺可下调血浆中ACh含量的原因尚需作更深入的研究。

参考文献：

[1]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南：2007年修订版[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30(1):8-17.

[2]曾荣繁.清热祛痰汤治疗老年慢性阻塞性肺疾病的临床研究[J].世界中医药,2013,8(7):741-743.

[3]王倩.针灸治疗慢性阻塞性肺疾病临床文献研究[D].广州：暨南大学,2014:34-35.

[4]张耀,杨涵棋,刘旭光.胆碱能通路调节机制在针灸研究中的应用[J].山西中医,2013,29(1):45-47.

[5]赵玉雪,何伟,荣培晶,等.胆碱能抗炎通路的研究进展[J].中华中医药杂志,2013,28(11):3312-3315.

[6]宋小莲,王昌惠,白冲.脂多糖结合熏烟法和单纯熏烟法建立慢性阻塞性肺病大鼠模型的比较[J].第二军医大学学报,2010,31(3):246-248.

[7]刘海涛,刘玉丽,宋思潼,等.大鼠“肺俞”穴的取穴方法探讨[J].针刺研究,2015,40(4):329-330.

[8]宋娜娜,刘俊,Bogdan Moldoveanu.迷走神经与肺部疾病[J].复旦学报(医学版),2012,39(2):117-122.

[9]耿文叶.电针对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠作用机制的研究[D].上海：复旦大学，2011：1-61.

[10]叶小丰,李建国,杜朝晖,等.电针“足三里”穴对大鼠迷走神经放电的影响[J].针刺研究,2006,31(5):290-293.

[11]胡森,王磊,周国勇.针刺足三里穴减轻烫伤大鼠肠缺血引起的氧自由基损伤[J].西北国防医学杂志,2010,31(1):1-3.

[12]刘丽芝,陈俊琦,吴秋萍,等.基于心率变异性分析针刺神门穴影响心率的机制[J].针灸临床杂志,2010,26(6):45-46.

[13]罗丽平,沈仲元,陈汉平，等.电针内关-间使对健康人心脏自主神经的调节作用[J].上海针灸杂志,2009，28(10):603-606.

[14]程淼,张新芳,张洁,等.针刺治疗对COPD模型大鼠Th1/Th2细胞亚群格局的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(2):399-402.

[15]张新芳,赵蜀军,蔡圣荣.电针足三里对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及白细胞介素-1β和白细胞介素-6的影响[J].安徽中医学院学报,2013,32(4):44-47.

[16]Borovikova LV, Ivanova S, Zhang M,et al.Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin[J].Nature,2000,405(6785):458-462.

[17]穆合代斯,阿不拉,娜几娜,等.迷走神经刺激激活胆碱能抗炎通路对犬心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].岭南心血管病杂志,2015,25(4):560-565.

[18]杜朝晖,李建国,王焱林,等.胆碱能抗炎通路对感染性休克大鼠肺的保护作用[J].武汉大学学报(医学版),2007,28(6):703-707.

[19]吕艺,孙丹,胡森,等.胆碱能递质对LPS刺激外周血释放细胞因子的影响[J].感染、炎症、修复，2003,4(4):220-223.

基金项目：国家自然科学基金项目(81373743；81072870)；安徽省自然科学基金项目(1408085MH201)；大学生创新创业训练计划项目(2014040)

作者简介：刘小云(1993-)，女，本科生

通信作者：刘自兵，zibingliu@163.com

[中图分类号]R563.3；R224[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.015

(收稿日期：2015-12-04；编辑：姚实林)

Effect of Electroacupuncture at Feishu Point on Vagus Nerve Discharge in Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

LIUXiao-yun1,LILu1,LIGeng-ru2,SHUQi1,FENGLi-yuan1,LINXian-gang1,XUYa-jing1,LIUZi-bing1,3

(1.ClinicalCollegeofAcupunctureandOrthopedics,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 3.InstituteofAcupunctureandMeridian,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture (EA) at Feishu point on vagus nerve discharge in rats with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and the mechanism of action of acupuncture in the treatment of COPD. MethodsA total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, EA normal group, model group, and EA model group. The rats in the latter two groups were treated with cigarette smoke combined with intratracheal instillation of lipopolysaccharide to establish the rat model of COPD. The content of acetylcholine (ACh) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and plasma was determined. The rats in the EA normal group and the EA model group were treated with EA at Feishu point, and vagus nerve discharge was observed before and after EA. ResultsThe EA normal group and the EA model group showed significant increases in discharge frequency, area, and amplitude of the vagus nerve in the left side of the neck after EA (P<0.05), and the EA model group showed significantly higher discharge frequency, area, and amplitude of the vagus nerve in the left side of the neck than the EA normal group (P<0.05). The model group showed a significantly higher level of ACh in the peripheral plasma than the normal group (P<0.05); the EA model group showed a significantly higher level of ACh in the peripheral plasma than the EA normal group but a significantly lower level of ACh than the model group (P<0.05). The EA normal group showed a significantly higher level of ACh in BALF than the normal group (P<0.05), and the EA model group showed a significantly higher level of ACh in BALF than the EA normal group and the model group (P<0.05). ConclusionEA at Feishu point can enhance vagus nerve discharge and promote the release of ACh in the lungs in rats with COPD.

[Key words]Chronic obstructive pulmonary disease; Electroacupuncture; Feishu point; Vagus nerve; Acetylcholine