五羟色胺对糖尿病大鼠脏器保护作用研究

王冬梅　董　轲　徐文瑾　 张金魁　黄国英　安月玲　刘　峰



五羟色胺对糖尿病大鼠脏器保护作用研究

王冬梅董轲徐文瑾 张金魁黄国英安月玲刘峰

青海清华博众生物技术有限公司(西宁 810016)

摘要：目的研究沙棘提取物中五羟色胺对糖尿病大鼠的脏器保护作用。方法高糖高脂饮食联合STZ造模糖尿病大鼠模型，随机分为单用安慰剂组、单用五羟色胺组、沙棘提取物提取五羟色胺组,观察糖尿病大鼠一般状况、血糖血脂变化情况。结果模型组在分别给予沙棘提取物提取五羟色胺、单用五羟色胺后，与安慰剂组相比，2组指标变化情况趋势一致，如下。血糖下降(P<0.01)，血脂下降(P<0.01)，下丘脑五羟色胺含量上升(P<0.01)，外周血五羟色胺含量下降(P<0.01)，其中沙棘提取物提取五羟色胺组和单用五羟色胺组差别不明显，无统计学意义。结论沙棘提取物中五羟色胺具有通过降低糖尿病大鼠血糖血脂水平从而保护糖尿病大鼠脏器的作用。

关键词：沙棘；沙棘提取物，五羟色胺，糖尿病

大量文献研究显示：沙棘提取物在降糖、降血脂、提高免疫力方面疗效显著[1～9]。五羟色胺提取困难，植物来源极为罕见，沙棘提取物中发现的五羟色胺为我们提供了新的研究思路[10]，本课题主要通过外源补充植物源性五羟色胺观察五羟色胺对糖尿病大鼠血糖血脂的影响，探讨植物源性五羟色胺对糖尿病大鼠的脏器保护作用。

1　材料和方法

1.1实验动物SD大鼠，40只，200～250 g，雄性，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京) 2012～0001。饲养环境通风良好，饲养温度18～22℃，湿度45～65%。

1.2实验药品1.2.1沙棘提取物由青海清华博众生物技术有限公司提供。采用青海沙棘果、果渣提取成浓度50%水提取物，乙醚、乙酸乙酯和三氯甲烷萃取沙棘水提液，HPLC定量沙棘提取物中五羟色胺含量为2.923μg/ml，沙棘提取物中五羟色胺得率为51%。95%乙醇和2%的盐酸纯化、干燥，收获纯沙棘五羟色胺备用，0.9%生理盐水溶液临用前配制，配制终浓度1μg/μl。

1.2.2STZStreptozotocin，链脲佐菌素注射液，美国SIGMA公司。按大鼠公斤体质量及所需试剂剂量，用微量秤称取所需试剂，用双蒸水配制0.1mol/L、PH=4.5的柠檬酸钠溶液,柠檬酸钠溶液配置1%的链脲佐菌素溶液，避光、4 ℃保存。按大鼠体质量分别用1ml注射器抽取STZ溶液备用。

1.3试剂大鼠5-羟色胺(5-HT)ELISA检测试剂盒大连范邦生物科技有限公司。

1.4实验仪器酶标仪BIO-TEK ELX-800, MagNA Lyser组织匀浆仪。

1.5实验方法1.5.1糖尿病大鼠模型制备将40只雄性SD大鼠(180±20)随机选取10只作为对照组(A组)，余下30只大鼠高糖高脂饲料饲喂4周后，腹腔注射STZ造模。造模方法如下。 STZ临用前溶解在pH=4.0的0.17mmol/L柠檬酸缓冲液内，25mg/Kg，1次/d，连续2d, 注射药物两天后测定大鼠空腹血糖(测试前禁食12h)，血糖值监测高于16.7mmol/L显示造模成功。1.5.2分组将造模成功大鼠随机分为3组。分别为：安慰剂组(B组)、五羟色胺组(C组)、沙棘提取物提取五羟色胺组(D组)。

1.5.3给药A组给予腹腔注射0.9%生理盐水溶液0.3ml/Kg。造模成功后，B组给予腹腔注射0.9%生理盐水溶液0.3ml/Kg，C组腹腔注射DOI 0.3mg/Kg，D组给予0.9%生理盐水溶液0.3ml/Kg，各组均自由饮食。

1.5.4标本采集最后一次给药一周后将大鼠用 10%水合氯醛麻醉(麻醉剂量0.35 mL/100 g),剖腹,腹主动脉采血,约 7～9ml，存放于2个非抗凝管中，其中一管送生化检验；另一管 4℃ 3000rpm 离心10分钟后留取血清存放于-80℃低温冰箱备用。取大鼠下丘脑。

1.6指标观察

1.6.1一般情况观察实验期间观察各组大鼠行为学、精神状态、体重、摄食情况等变化。

1.6.2血糖检测观察大鼠用药前后血糖的变化情况。

1.6.3血清及下丘脑五羟色胺水平检测[11]大鼠腹主动脉取血少量检测血糖血脂值，余下标本4℃、3500 r/min离心 10 min, 取上清液, -20 ℃冻存，血清五羟色胺含量按照试剂盒说明书检测。下丘脑称重,加 9 倍量冷生理盐水(生理盐水的体积为下丘脑质量的 9 倍), 10 000 r/min 研磨制成 10%组织匀浆, 4℃、2000 r/min 离心 10 min,取上清液,-20 ℃保存。按照试剂盒说明书检测下丘脑五羟色胺含量。

2　结果

2.1一般状态造模前各组大鼠精神状态良好、毛色光泽、活泼好动。模型组大鼠在注射STZ后体重呈缓慢增长、逐步较前下降、消瘦走势,神态倦怠、皮毛散乱无光泽、喜扎堆或蛰伏、观察发现有多饮、多尿、多食等糖尿病症状。造模成功大鼠28只，实验组分3组给药，其中C组和D组大鼠在给药后精神状态逐渐好转,消瘦走势减缓，体质量有上升趋势，逐渐由喜扎堆蛰伏状态开始变得活波，观察发现多饮多食多尿等症状有所好转，但大鼠整体状态仍略逊于对照组，安慰剂组大鼠精神状态最差。

2.2体质量变化对照组大鼠生长良好,体质量持续增加,无其他症状。对照组和造模组大鼠分别喂养4周后，造模组大鼠体质量明显增加，出现明显的腹型肥胖。STZ注射后，模型组大鼠造模成功28只，随机分3组分别为安慰剂组(B组)、五羟色胺组(C组)、沙棘提取物提取五羟色胺组(D组)，各实验组用药后，大鼠体质量出现不同的变化趋势。其中对照组(A组)大鼠体质量正常增加，B组大鼠体质量出现初期快速下降，后期下降减缓趋势；C组、D组用药后大鼠质量重出现先下降，后逐渐回升趋势，但体质量仍低于正常组。各组大鼠体质量变化情况如下。见表1。

表1　对照组大鼠与各实验组大鼠体质量变化

注：2)表示与对照组相比，P<0.01, 差异有统计学意义

2.3各组大鼠血清和下丘脑五羟色胺含量变化情况造模成功后B组大鼠与A组相比，血清中五羟色胺含量升高，下丘脑中五羟色胺含量下降。C组和D组在给药后，均可见大鼠血清中五羟色胺含量略有下降，与B组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，但不能达到对照组血清中五羟色胺含量水平(P<0.01，差异有统计学意义)；造模后B组大鼠下丘脑五羟色胺含量明显下降，与A组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，C组和D组经治疗后，大鼠下丘脑五羟色胺含量与安慰剂组相比明显升高(P<0.01，差异有统计学意义)，但含量仍低于A组(P<0.01，差异有统计学意义)，其中D组五羟色胺含量略高于C组，但差异无统计学意义。见表2。

2.4大鼠血清中总胆固醇和甘油三酯含量变化糖尿病大鼠在造模成功后，B组血清中总胆固醇和甘油三酯含量持续升高，与A组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。C组和D组在给药后，总胆固醇和甘油三酯含量下降，与安慰剂组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。其中D组下降程度略大于C组，但差异无统计学意义。见表3。

表2　大鼠各组血清和下丘脑五羟色胺含量

注：2)表示与安慰剂组相比，P<0.01，差异有统计学意义

表3　第13周大鼠对照组及实验组总胆固醇和甘油三酯含量

注：2)表示与对照组相比，P<0.01, 差异有统计学意义

3　讨论

目前国内外对沙棘的研究很多，探讨沙棘中新发现成份和功效可以为开发沙棘新产品提供重要的研究及转化方向。沙棘提取物在降糖、降脂、提高免疫力方面疗效显著。经过国内外专家的不懈努力，沙棘对糖尿病患者的脏器保护作用已经得到了学术上的认可。大量文献研究显示：沙棘提取物(沙棘黄酮、维生素、矿物质、微量元素、SOD等)能降低血糖、控制糖尿病的病情进展，提高患者生存质量。五羟色胺作为一种神经递质，对人体神经、情志、内分泌系统有影响，研究发现糖尿病大鼠体内五羟色胺含量明显不同于正常大鼠，探讨五羟色胺对糖尿病大鼠的脏器影响具有重要意义。

英国剑桥大学Addenbrooke’s医院周里钢等[12]研究发现，五羟色胺受体激动剂可以改善2型糖尿病的黑色素皮质素受体通路，通过建立下丘脑-脊髓-外周肌肉-白色脂肪之间有效的中枢神经-外周组织通路,最终改善外周肌肉和脂肪组织的葡萄糖的代谢过程，有效地改善肥胖小鼠葡萄糖耐量和胰岛素抵抗，为我们探索通过中枢神经系统作用于外周组织防治2型糖尿病提供了理论基础。

本研究结合周里钢等实验研究基础，采用体内补充外源性五羟色胺的方法，验证五羟色胺对糖尿病大鼠血糖血脂的影响，从而判断五羟色胺是否对糖尿病大鼠具有脏器保护作用。本研究在糖尿病大鼠造模成功后，可见伴随着糖尿病大鼠血糖、血脂的升高，外周血血清五羟色胺含量逐渐升高，而下丘脑五羟色胺含量反而下降(安慰剂组与对照组相比，差异明显，P<0.01，具有统计学意义)；当模型组分别给予DOI和沙棘提取物提取五羟色胺后，可见随着血糖血脂指标的下降，外周血血清中五羟色胺含量反而下降，而下丘脑五羟色胺含量逐渐上升(C组、D组与B组相比，差异明显，均P<0.01，具有统计学意义)，给药后两组血糖、血脂数据变化趋势向正常大鼠转变，但均不能达到正常水平(C组、D组与B组相比，差异明显，均P<0.01，具有统计学意义)。

已有研究表明五羟色胺含量变化可以影响血脑屏障通透性的改变。本研究的结果提示，补充外源五羟色胺可以有效改善糖尿病大鼠血糖血脂指标，其机制可能与补充外源五羟色胺后改变了血脑屏障的通透性，间接提高了下丘脑五羟色胺含量有关。同时，研究发现给药后，沙棘提取物组对血糖血脂的改善效果明显优于五羟色胺组(C组与D组相比，差异无统计学意义)，具体机制尚待进一步的研究。总之，本研究显示沙棘提取物通过外源补充的方式可以有效对糖尿病大鼠起到降糖、降血脂的作用，其中植物源性五羟色胺的作用居功至伟。

最初外源补充的五羟色胺是从动物血液及肠黏膜中提取的，容易产生交叉感染、过敏性反应的现象，并且存在血制品污染和动物中的病毒、细菌感染的危险。为了避免以上问题，从植物中提取天然、绿色的5-羟色胺尤为重要，受限于五羟色胺植物来源极为罕见，沙棘提取物中新发现的五羟色胺为我们提供了一个重要的研究思路。本研究进一步验证了沙棘提取物中植物源性五羟色胺对糖尿病大鼠的降血糖、血脂的效果，为开发沙棘提取物新产品提供了良好的应用前景。

参考文献

[1]J.Santos,M.Zaniquel i,et al. Aluminum Ion Complex Formation with 3-Hydroxy Flavone in Langmuir and Langmuir Blodgett Films[J].Colloids and Surfaees, 2002,(198):569-576.

[2]S.Gayot,X Santareli,D Coulon.Modifieation of Flavonoid Using Lipase in Non-conventional Media:Effect of the Water Content[J].Joumal of Biotechnology, 2003,(101):29-36.

[3]周原生，烈 勇，王 玥，等. 沙棘萃取物降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖[J] . 国际沙棘研究与开发，2007,12( 5) :14-15.

[4]Baoru Yang, HeiKKI Kallio.Composition and Physiological effects of sea buckthon (hiPPophae) liPids[J].Trends in Food Seience& Technology, 2002,13(5):160-167.

[5]黄桂红，贺 敬. 链脲佐菌素致糖尿病小鼠模型的建立及抗氧化能力的影响[J].中国药事，2009,23(8) :755-757.

[6]涂献玉，王文英，邓德明，等.低聚原花青素对STZ糖尿病小鼠血糖水平的影响[J] .长江大学学报(自然科学版)，2006,12(4):247-249.

[7]Vahid Bilaloglu Guliyeva,Mustafa Gulb.Hippophae rhamnoides L. Chromatographic methods to determine chemical composition,use in traditional medicine and pharmacological effeets[J].Jourmal of Chromatography B,2004,812:291-307.

[8]Yuangang Zu, Chunying Li, Yujle Fu, et al. Simultaneous determination of catechin, rutin, quercetin, kaempferol and isorhamnetin in the extract of sea buckthorn(Hippophae rhamnoides L)leaves by RP-HPLC with DAD[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006,41:714-719.

[9]Xing J, Yang B, Dong Y, et al .Effeets of sea buekthorm (hippophae rhamnoides L.)seed and pulp oil on experimental models of gastric ulcer in rats[J]. Fitoterapia, 2002,73:644-650.

[10]刘忠．藏药沙棘的化学成分概述[J]．中国民族民间医药杂志2004(3):147-148.

[11]王路，王德山，刘旭东,等.眼针对抑郁模型大鼠海马及下丘脑五羟色胺表达的影响[J].中华中医药学刊，2014，32(5)990-992.

[12]周里钢.五羟色胺2C受体激动剂改善2型糖尿病的黑色素皮质素受体通路探讨[A].2008中国医师协会内分泌代谢科医师分会年会论文汇编[C].2008：49-52.

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.05.022 1.2.31-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride,1- (2,5-二甲氧基-4-碘苯基)-2-氨基丙烷盐酸盐;五羟色胺受体激动剂,Sigma,St.Lous, MO,纯度≧98%。按大鼠公斤体质量及所需试剂剂量，用微量秤称取所需试剂, 0.9%生理盐水溶液临用前配制，配制浓度1μg/μl。

文章编号：1003-8914(2016)-05-0655-04

收稿日期：(本文校对：刘言言2015-07-09)

Research on 5-HT in Seabuckthorn Extract Protection Diabetic Rats from Organ Injury

WANG DongmeiDONG KeXU WenjinZHANG JinkuiHUANG GuoyingAN YuelingLIU Feng

(Qinghai Tsinghua Biotry Bio-Tech Company Limited, Qinghai, Xi'ning 810016, China)

Abstract：ObjectiveTo observe 5-HT (5-hydroxytryptamine) in seabuckthorn extract protect diabetic rats from organ injury. MethodsFed high sugar and high fat diet joint low-doses streptozotocin (STZ ) build typeⅡdiabetic rat model. The diabetic rats were randomly divided into the placebo group (group B), use of 5-HT group (group C) and use of seabuckthorn extract group (group D). After diabetic rats were dealt with different treatment methods, the changing of the general condition, blood sugar and blood fat levels in those diabetic rats were observed. ResultsThe model group was given after feeding seabuckthorn extract or using 5-HT respectively, comparing with the placebo group, groups C and D variation tendency were consistent, as follows: the blood sugar (P < 0.01) and blood lipid decreased (P < 0.01), the hypothalamus 5-HT increased (P < 0.01), the peripheral blood serum 5-HT levels decreased (P < 0.01), of which the seabuckthorn extract group and 5-HT group difference were not obvious, there was no statistical significance. ConclusionSeabuckthorn extracts of 5-HT can protect diabetic rats from organ injury through decreasing diabetic rat's blood lipid and sugar levels.

Key words：Seabuckthorn; Seabuckthorn extract; 5-HT; Diabetes