沈阳某鸡场大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验

张雅为，刘耀川，魏　澍，朱江巍，赵晓彤，曹　东

(1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164；3.辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁沈阳 110161)



沈阳某鸡场大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验

张雅为1,2，刘耀川3，魏澍1,2，朱江巍3，赵晓彤1,2，曹东1,2

(1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164；2.辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164；3.辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁沈阳 110161)

摘要：对沈阳市某肉鸡养殖场的85例病死鸡进行大肠埃希菌的分离鉴定及药物敏感性试验，结果分离到大肠埃希菌62株，分离率为72.9%，分离菌株对头孢氨苄全部耐药，对其余抗菌药物的耐药率在0～88.7%之间，多重耐药情况普遍。

关键词：大肠埃希菌；分离；鉴定；药物敏感性；多重耐药

大肠埃希菌为养禽业主要致病细菌之一，其致病性菌株能够引起多种疾病，主要能够引起鸡的腹膜炎、关节炎、肠炎、心包炎、肉芽肿、肝周炎及败血症等[1]。由于禽大肠埃希菌血清型多样，临床症状复杂，并常见其他细菌性疾病协同感染，对养殖业造成巨大威胁。临床上常用抗菌药物对禽大肠埃希菌引起的疾病进行治疗[2]。但随着抗菌药物的不断使用，耐药菌株逐渐增多，给疾病治疗与防控带来新的挑战[3]。本试验通过对沈阳某肉鸡养殖场病、死鸡进行大肠埃希菌分离和鉴定，并对分离株进行药物敏感性测试，为该场鸡大肠埃希菌病的防治提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料在沈阳某大型肉鸡养殖场，选取临床症状及病理变化为疑似大肠埃希菌病的鸡85只，主要症状为气囊炎、败血症、腹膜炎等。无菌采集濒死或病死不超过24 h鸡的心脏、肝脏、气囊、脾脏及血液等作为病料。

1.1.2培养基及生化反应鉴定管营养肉汤(NB)、麦康凯琼脂,北京奥博星生物技术有限公司产品；MH(B)培养基,青岛高科园海博生物技术有限公司产品；肠杆菌科生化常规鉴定管,杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.3仪器设备酒精灯，离心管，接种环，恒温培养箱，洁净工作台，高压灭菌锅，平皿和锥形瓶等。

1.1.4药物标准品氧氟沙星(97.8%)、头孢唑啉(99.1%)、庆大霉素(62.0%)、恩诺沙星(99.9%)、氟苯尼考(99.2%)、甲砜霉素(99.7%)、土霉素(88.2%)、环丙沙星(98.3%)、头孢噻呋(88.2%)、头孢氨苄(95.3%)、阿莫西林(79.9%)、多西环素(82.2%)药物标准品，大肠埃希菌ATCC25922，购于中国兽医药品监察所。

1.2方法

1.2.1大肠埃希菌初步分离无菌操作采集病、死鸡的相应组织，直接划线接种于经无菌检验合格的麦康凯琼脂培养基平皿中，于37 ℃培养18 h。挑取典型红色金属光泽的光滑、圆形菌落，于无菌检验合格的营养肉汤中扩增，保存于含300 mL/L的甘油中，置-20 ℃保存待用。

1.2.2大肠埃希菌生化鉴定按照购买的肠杆菌科生化常规鉴定管说明书要求，对初步分离的大肠埃希菌进行葡萄糖、乳糖、鸟氨酸、苯丙氨酸、硫化氢、蛋白胨、赖氨酸、卫矛醇、尿素、氨基酸对照及枸橼酸钠等11项生化反应。根据37 ℃培养18 h结果对其进行编码，最后根据编码手册判定细菌类型。并将最终经生化反应确定的大肠埃希菌保存待用，其余非埃希菌经灭菌后丢弃。

1.2.3大肠埃希菌分离株药敏试验

1.2.3.1菌液制备将保存的大肠埃希菌接种于麦康凯琼脂平板培养基，于37 ℃培养24 h，挑取麦康凯琼脂培养基中典型单菌落接种于无菌检验合格的MH肉汤中，在37 ℃摇床振荡培养至菌液浓度约为1×108CFU/mL备用。使用时，用无菌MH肉汤将其稀释成浓度为1×105CFU/mL的应用菌液。

1.2.3.2抗菌药液制备准确称量各抗菌药物标准品，并按照说明使用适当溶剂溶解，配制为1 280 μg/mL浓度的原药液，于4 ℃保存、备用。使用时对其进行2次稀释，使用药液的浓度约在0.125 μg/mL～128 μg/mL之间。

1.2.3.3抗菌药物最小抑菌浓度测定根据美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)推荐的标准，采用肉汤微量稀释法测定12种抗菌药物对大肠埃希菌分离株的MIC，每种抗菌药物重复3个平行。同时用大肠埃希菌标准株 ATCC25922作为质控菌。

2　结果

2.1鸡大肠埃希菌分离鉴定结果

对85例病、死样品进行初筛，得到疑似大肠埃希菌77株，大肠埃希菌初筛分离率为90.6%；77株初筛菌株经肠杆菌科生化常规鉴定管鉴定后，最终确定62株为大肠埃希菌，鉴定阳性率为80.5%。该养殖场大肠埃希菌分离率为72.9%。生化鉴定结果见表1。

2.2大肠埃希菌分离株药敏试验结果

分离的62株大肠埃希菌对头孢氨苄高度耐药，耐药率为100%；对其余抗菌药物的耐药率分别为：甲砜霉素88.7%、氟苯尼考69.4%、土霉素66.1%、头孢唑林53.3%、恩诺沙星41.9%、阿莫西林35.5%、庆大霉素30.6%、多西环素19.4%、氧氟沙星14.5%、环丙沙星12.9%；62株分离株对头孢噻呋敏感，无耐药分离株。12种抗菌药物对62株大肠埃希菌分离株MIC测定结果见表2。

表1　77株疑似大肠埃希菌生化鉴定结果

表2　12种抗菌药物对62株大肠埃希菌分离株的MIC

2.3大肠埃希菌多药耐药情况分析

本试验受试抗菌药物属于6类，3种为头孢菌素类，3种为氟喹诺酮类，2种氯霉素类，2种四环素类，1种氨基糖苷类，1种β内酰胺类。62株大肠埃希菌分离株中5株(8.1%)耐2类药，31株(50.0%)耐3类药，22株(35.5%)耐4类药，13株(21.0%)耐5类药。多药耐药情况见图1。

3　讨论

禽源大肠埃希菌分离率高、危害大，且对临床常用抗菌药物均表现出不同程度的耐药情况。有报道称，山东地区肉鸡大肠埃希菌对土霉素、酒石酸泰乐菌素、对磺胺-6-甲氧嘧啶、氨苄西林钠及阿莫西林的耐药率分别为96.0%、99.0%、99.5%、100%及100%[4-5]。河北地区大肠埃希菌分离株对上述药物的耐药率均为100%。辽宁地区肉鸡大肠埃希菌对上述药物的耐药率分别为100%、100%、97.1%、94.3%及94.3%[6]。辽西地区禽源大肠埃希菌药物敏感性试验表明，分离株对氟苯尼考、头孢噻呋、左旋氧氟沙星、盐酸沙拉沙星比较敏感，对环丙沙星、黏杆菌素、阿米卡星、利福平等耐药[7-13]。

图1　大肠埃希菌分离株多药耐药情况

本试验发现，该肉鸡养殖场大肠埃希菌分离率为72.9%，共分离得到大肠埃希菌分离株62株。对分离株进行临床常用药物敏感性试验发现，分离株对头孢氨苄全部耐药，对其余抗菌药物的耐药率在0～88.7%之间。对甲砜霉素、氟苯尼考、土霉素及头孢唑林耐药率较高；对头孢噻呋敏感，无耐药菌株。多药耐药分析发现，分离株3重耐药菌株最多，为50%，其他依次为4重、5重及2重多药耐药。说明分离株已对多种抗菌药物产生不同程度的耐药。与报道的其他地区的禽源大肠埃希菌耐药情况比较，该场分离株为中等耐药水平，可能与该场的用药、治疗习惯有关。并推荐该场使用敏感性高的药物(如头孢噻呋)对大肠埃希菌病鸡进行治疗。

参考文献:

[1]郝智慧，肖希龙，邱梅，等.不同区域鸡大肠杆菌对抗菌药的耐药性比较[J].中国兽医科学，2009,39(1):84-88.

[2]曾祥岗，向寿甫.鸡大肠杆菌病的诊断与防治[J].中国畜牧兽医文摘，2015,31(6):189.

[3]邹玲，刘晓飞，任慧英.鸡肠道大肠埃希菌的分离鉴定及对噬菌体的敏感性测试[J].动物医学进展，2014,35(9):82-84.

[4]王书全.辽西地区鸡大肠杆菌分离鉴定、药敏及IHA诊断液制备[J].中国畜牧兽医，2011,38(7):224-228.

[5]底丽娜，赵红琼，夏立宁，等.新疆不同动物源大肠埃希菌耐药性比较[J].动物医学进展，2015,36(1):121-127.

[6]孙立军.肉鸡大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的诊治[J].中国畜禽种业，2015(3):151.

[7]肖玲.肉仔鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定与药敏试验[J].家禽科学，2015(8):49-50.

[8]王建国，李秀丽，范寰，等.乳酸菌发酵物与中药配伍对预防鸡大肠杆菌病协同作用的研究[J].中国畜牧兽医，2015,42(7):1890-1896.

[9]林大捷.鸡大肠杆菌分离鉴定与药敏试验研究[J].黑龙江畜牧兽医，2015(4):108-111.

[10]段俊秀.鸡大肠杆菌的分离鉴定及耐药性试验[J].现代农村科技，2015(5):55-57.

[11]张遂平，杨建春，邵艳华.鸡大肠杆菌分离及药敏试验研究[J].中国畜牧业，2013(2):62-63.

[12]刘红玉，王君玮，王娟，等.胶东地区健康禽源大肠埃希菌耐药性与整合子-基因盒携带分析[J].动物医学进展，2014,35(10):66-70.

[13]刘香敏，王平，郭妍妍，等.鸡源致病性大肠杆菌血清型鉴定及耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2015 (9):188-192.

收稿日期：2015-12-16

基金项目：辽宁省农业领域青年科技创新人才培养计划项目(2015015)

作者简介：张雅为(1981-)，女，辽宁丹东人，高级兽医师，硕士，主要从事预防兽医学相关研究。

中图分类号:S852.612;S858.31

文献标识码:B

文章编号:1007-5038(2016)07-0120-03

Isolation,Identification and Drug Susceptibility Tests ofEscherichiacoliIsolates Obtained from a Chicken Farm in Shenyang

ZHANG Ya-wei1,2,LIU Yao-chuan3,WEI Shu1,2,ZHU Jiang-wei3,ZHAO Xiao-tong1,2,CAO Dong1,2

(1.AnimalEpidemicPreventionandControlCenterofLiaoningProvince,Shenyang，Liaoning，110164,China;2.VeterinaryMedicineResearchInstituteofLiaoningProvince,Shenyang，Liaoning， 110164,China;3.TheEmergencyCenterforSignificantAnimalepidemicDiseaseofLiaoningProvince,Shenyang，Liaoning，110161,China)

Abstract:In this study,Escherichia coli strains were isolated from 85 sick or dead chickens in Shenyang.Isolates were identified,and drug susceptibility tests were carried out.The results showed that,62 isolates were obtained with the 72.9% isolation rate.All isolates were resistant to cefalexin and 0-88.7% to other antibacterial agents.The multi-drug resistance was widespread.

Key words:Escherichia coli; isolation; identification; drug susceptibility test; multi-drug resistance