鸡毒支原体研究概况

王育伟，岳　华，张晓晖，周爱民，李廷见，毛东林，肖　龙

(绵阳市农业科学研究院，四川绵阳 621000)



专论与讲座

鸡毒支原体研究概况

王育伟，岳华，张晓晖，周爱民，李廷见，毛东林，肖龙

(绵阳市农业科学研究院，四川绵阳 621000)

摘要：鸡毒支原体(MG)是对养禽业危害很大的支原体，主要导致禽类慢性呼吸道疾病(CRD)，以禽的结膜炎、产蛋率及饲料转换率下降、屠宰率下降等为主要特征。MG可通过垂直和水平传播方式在鸡群中传播，每年给全球家禽产业带来巨大经济损失。随着对MG细胞表面抗原黏附素蛋白(pMGA)和PvpA、GapA的结构与功能研究的深入，K株、TG5株等MG疫苗研究也取得较大进展。由于抗生素的滥用，MG基因中也发生耐药突变，产生了QRDRs等抗药结构，导致MG在耐药性上也出现新的特点。论文主要对国内外MG的疫苗开发、耐药情况和检测技术等进行综述，旨在对家禽MG的综合防控提供借鉴。

关键词：鸡毒支原体；检测；疫苗；防控；耐药性

鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)是致病性最强、引起损失最大的支原体，主要导致鸡慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)。MG在禽体内潜伏6 d～21 d后，可使患禽出现呼吸道啰音、咳嗽、流鼻涕等症状，部分表现为结膜炎、眶下窦炎。CRD虽然致死率不高，但严重影响家禽产蛋率、孵化率和饲料转化率，给养殖企业造成重大经济损失。随着人们长期用药不规范，使得MG获得对泰乐菌素、替米考星等药物产生了可遗传耐药性[1]，有关MG的抗原特征、耐药性情况、疫苗研究也取得了一些进展。

1　病原学特征

1.1病原

鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)是目前发现的最小(0.25 μm～0.5 μm)、最简单的原核生物，属于软皮体纲支原体目。MG经吉姆萨染色在镜下呈球状，可在含马、猪灭活血清的培养基上生长，形成大小为0.2 mm～0.3 mm中央凸起且光滑的圆盘状菌落。MG血清型属于A型，可发酵葡萄糖和麦芽糖，产酸而不产气，对琼脂培养基中的马血清具有溶血特性。

1.2抗原及毒力因子

多项研究证明禽类发生呼吸道症状与MG的表面抗原相关，目前，已经发现MG胞浆膜上有200多个特征性多肽，其中对黏附素和血凝素研究相对深入。MG黏附素蛋白(protein of MG adhesion,pMGA,p67) 是MG的细胞膜蛋白，之后又发现了p52和p77。在ts-11和S6菌株证明有P67(pMGA)存在,通过pMGA单克隆抗体的抵抗红细胞凝集作用，表明pMGA在促进红细胞凝集中发挥重要作用。在S6株的研究中，加入pMGA抗体后表达频繁的pMGA1.1变为pMGA1.9，说明了pMGA可高度自我调节以保持MG的正常生理功能。

黏附素变相蛋白(phase variant protein of adhesion，PvpA)是由PvpA基因家族编码的48 ku～55 ku蛋白，主要存在于MG细胞膜内。体外试验表明抗体反应与PvpA的表达与变异均相关，说明PvpA蛋白在免疫调节方面发挥重要作用。PvpA具有高度变异性，可通过变异编码不同抗原蛋白，在协助MG逃逸方面起重要作用[2]。MG含有大小为105 ku的蛋白(GapA)，利用GapA抗体Fab片段特异性阻断GapA后MG的侵染能力下降，表明GapA蛋白具有促进MG定植的作用[3]。人们还发现GapA+的ts-11菌株比GapA-菌株需要更少的剂量便达到同样的免疫效果，说明了GapA蛋白在促进免疫反应方面具有重要作用[4]。至今为止，研究人员不断发现MG的重要蛋白，还未发现MG产生毒素。

2　检测技术

尽早准确检测MG直接影响着家禽健康与经济效益，关系到我国现代化家禽业发展，随着现代分子生物学的发展，大量基于DNA及蛋白的先进检测方法取得了明显进展。

2.1酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是伴随着单克隆抗体(MAb)技术产生的一种血清检测技术，特异性和敏感性明显提高。Rocha T S等[5]利用重组的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶重要蛋白r-E2，获得兔多抗血清后进行rec-ELISA检测MG，该方法具有高特异性，且未发现MS和MI的抗原交叉性。我国农业行业标准NYT553中采用的间接荧光抗体试验(IFA)，也是将荧光检测与血清学方法结合。宁官保等[6]通过胶体金试纸条技术实现了MG的快速检测，精确度达到94.5%。总体看来，血清学诊断相关技术虽未能做到对MG的准确诊断，但在MG患禽的筛选与辅助诊断中具有重要意义。

2.2分子生物技术

随着分子生物学技术的快速发展，聚合酶链反应(PCR)技术在MG的检测中越来越广泛。PCR技术利用TaqDNA聚合酶等实现样本微量DNA的快速扩增，借助于荧光等标记实现定量检测，具有特异性强、敏感性高、操作简便、高效等优点。16 S rRNA基因序列中存在的V3和V4高变区，有人将其作为细菌鉴定的分子依据，只是16 S rRNA PCR技术检测MG的特异性仍待提升。real-time PCR技术是对特定的DNA序列定量检测最灵敏的方法之一，Raviv Z等[7]利用对mgc2、16-23 S进行基因检测，可同时检测MG、MS、MM和MI等支原体，具有非常高的特异性和准确性。赵杰等[8]设计了gapA-F/gapA-R、mgc2-F1/mgc2-R1、mgc2-F2/mgc2-R2等5对引物进行MG的套式PCR检测，发现mgc2引物的检测灵敏度高达57.6 pg/μL，且与MS无交叉性。同样，随意扩增DNA多态性分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是在PCR基础上发展起来的分子标记技术，可根据PCR产物长度实现鉴别[9]。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增技术，以MG丙酮酸脱氢酶复合体PDHa基因对MG进行LAMP检测，发现检测灵敏度比现有PCR方法高10倍以上[10]。重叠延伸聚合酶链反应(splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE-PCR)是用来插入特定突变在特定点的序列或拼接较小的DNA片段到1个较大的多核苷酸，也是检测MG感染的重要手段[11]。

3　疫苗研发

3.1灭活疫苗

灭活疫苗具有安全、稳定和易保存等优点，解决了MG感染带来的产蛋率下降问题。MG灭活疫苗是通过加热或化学(如甲醛)方法将MG灭活后，刺激动物产生体液免疫。目前我国市场上主要灭活疫苗3G呼净威，疫苗株为MG的F36株，通过2次～3次颈部皮下注射免疫后，家禽可获得较好的免疫保护效果。MG油乳剂灭活苗能引起机体产生较强的免疫应答，安全、不散毒，该疫苗可护卫鸡群免受强毒株(R株)的攻击，在一定程度上可防止MG经蛋传播。然而疫苗使用降低了MG排放量从而减轻CRD症状，但不能抑制MG的水平传播。Tan L等[12]将MG GroEL蛋白重组成功表达在大肠埃希菌BL21(DE3)与pET-28a(+)载体后具有ATP酶活性，补体依赖性杀菌试验表明，兔抗血清rGroEL具有类似于MG诱导鸡抗血清的良好杀菌效果，提示GroEL作为一种新型候选灭活疫苗。

3.2弱毒疫苗

弱毒疫苗是目前用于预防CRD的主流疫苗，具有免疫反应快、用量少等优点。国外已开发了MG ts-11株、MG6/85株和F株等，我国也有MG活苗F36株。F株是应用时间最长和最广泛的疫苗，能明显提高患病鸡的产蛋量。近年来人们发现其具有引发感染的潜在威胁，F株免疫没有取代其他毒株反而感染未接种的鸡群，MG F株可经蛋传方式传播给子代鸡[13]。

在安全性方面，MG 6/85株和MG ts-11株对非目标鸡群的水平传播能力差，其安全性要比F菌株明显高很多。MG疫苗ts-11株是是由澳大利亚田间分离株80083株经化学诱变和温度敏感(33℃)筛选方式研制的疫苗，具有毒性小、传播差的特点。Biro J等[14]对49 日龄鸡的疫苗安全性进行了评价，TS-11菌株在体重、病变和临床表现方面均具有良好安全性。MG6/85株是由美国研发的疫苗，主要用于预防蛋鸡产蛋下降，对产蛋率、蛋重和蛋壳强度影响不大，是目前比较安全的活疫苗。

美国乔治大学Ferguson-noel N M等[15]在2012年研发出的MG活苗K株，接种10 d～39 d后未见气囊及气管明显损伤，说明其具有较好的安全性。保护性试验发现K株MG气雾免疫后对R株的保护周期可达7周，5个世代的毒力测定未见到MG毒力返强。另外，K株具有表型稳定且不会垂直传播的优点，具有较高的安全性和MG疫苗开发潜力，因此K株在保护蛋鸡和肉鸡方面具有较高的应用价值[16]。目前我国市售活疫苗菌株主要是F36株，由青岛易邦生物工程有限公司、浙江诺倍威生物技术有限公司等多个公司生产，国内外常见疫苗株研发及特征见表1所示。

表1　国内外MG相关疫苗及特征

注(Note)：IM= intramuscular injection,IH= subcutaneous injection.

4　防控技术

4.1抗菌药物治疗

抗菌药物是目前预防和治疗MG感染的主要手段之一，为养殖企业减少了经济损失。大环内酯类抗菌药物为首选，如红霉素、罗红霉素和阿奇霉素等，氟喹诺酮类如左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星等，四环素类也用于MG的治疗。近年来，MG耐药性菌株的交叉耐药越来常见，甚至分离到了对8种抗生素同时耐药的超级MG[17]。有研究比较了S6、ts-11、6/85及本地MG株的耐药性，表明除土霉素、金霉素和硫姆林外，恩诺沙星、林可霉素等均具一定敏感性[18]。研究称MG对多西环素(0.20 μg/mL)和硫姆林(0.10 μg/mL) 最敏感，恩诺沙星、金霉素和林可霉素表现出耐药性。最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)是用来评价MG对药物敏感性的重要指标。刘轶秋等[19]将S6株和R株在含替米考星的液体培养基中进行耐药MG筛选，发现经6代～8代培养后MIC便可升至128 μg/mL。研究发现替米考星耐药菌株R株、PG31株和S6均对大环内酯类药物表现交叉耐药性，MG仅对沃尼妙林敏感。

近年来，MG交叉耐药性机理研究越来越深入，耐药结构的产生成为MG耐药机理研究热点。喹诺酮类药物耐药决定区(quinolone resistance-determining regions，QRDRs)是影响MG对喹诺酮药物敏感性的重要结构，与DNA促旋酶和拓扑异构酶IV基因序列及氨基酸序列紧密相关[20]。Reinhardt A K等[21]对MG突变株QRDRs的氨基酸测序结果表明Ser、Gln等8个氨基酸互换，与gyrA基因81、83、84和87处出现4个突变点有关，导致QRDRs蛋白构相发生变化。23 S RNA靶位的Ⅴ和Ⅱ区域蛋白结构变异是引起大环内酯类抗药性的重要原因，与2 058、2 059和2 611等位点碱基突变有关[22]。GTS序列测定对比表明耐药性菌株23 S rRNA出现了2 058、2 059、2 061、2 447和2 503等关键碱基位点碱基突变[19,22]，机理可能涉及碱基转换改变导致密码子、蛋白质的三级结构的变异而隐蔽了氯霉素和氟苯尼考等的结合位点[23]。在中药治疗方面，陈美安等[24]体外研究表明两面针、板蓝根、黄连等提取物对MG具有抑制作用，对MG中药防治进行了有益的探索。

4.2疫苗免疫接种

疫苗免疫接种是提高机体抗MG感染的最有效手段，在禽业生产中占据着重要的地位。MG油乳剂灭活疫苗不仅可保护R株等强毒株侵袭，还可提高商品蛋鸡产蛋率；在控制RCD发病和降低染病禽MG排毒量方面效果明显。Merial、MSD和Zoetis等国外疫苗公司先后开发出F株、ts-11、S6和6/85菌株等弱毒疫苗，保护力和安全性不断提高，显著降低了因产蛋率下降和气囊炎所带来的损失。近年来，虽无直接证据表明F株、ts-11、S6和6/85株等疫苗的致病性，弱毒疫苗在生物安全上存在返强的可能性。因此，相关工作者应根据当地MG毒株类型有选择地进行疫苗免疫。

4.3管理措施

有效的生物安全措施是控制MG的基础，也是切断MG传播途径非常有效的手段，浸蛋法和加热法(46.1℃)就是通过切断MG的蛋-蛋垂直传播途径起作用的。MG的检测依赖于PCR、RAPD等先进的技术，目前美国执行的NPIP在原种鸡上取得的MG净化成绩得益于此。随着MG Rlow株的全基因测序完成，结合先进检测技术实施净化程序，有利于无支原体感染种鸡群的培育。MG研究中也发现QRDRs等耐药结构的产生，WHO、欧盟先后制定了相关政策对治疗用抗菌药物生长促进剂(AGP)使用，可见抗生素合理使用也是重要的防控手段。

5　小结

综上所述，MG作为对禽类威胁最大的支原体，其综合防控与净化是一项系统工程。首先，准确而快速的诊断技术是做好MG防控工作的基础，NPIP和巴西国家家禽健康计划(plano nacionalde sanidade avícola,PNSA)都说明了快速检测的重要意义。随着分子生物学技术的发展，应借助先进检测手段达到防控MG的目的。单一或多重PCR技术、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)、RAPD等分子生物学方法越来应用越多，对保障禽业健康发展起到了重要作用。疫苗免疫在控制CRD和提高企业经济收益方面非常重要，但应做好疫苗特异性与安全监测工作。由于全球抗菌药物的研发速度远低于MG耐药性产生的速度，ts-11株等疫苗株的研发与更新仍然是保障禽业安全的重要手段。

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收稿日期：2015-12-28

基金项目：绵阳市科技支撑计划项目(14N-03-2)；绵阳市农业科学研究院科技创新项目基金

作者简介：王育伟(1982-)，男，山东济南人，助理研究员，博士，主要从事畜禽疫病防控及品种选育工作。

中图分类号:S852.62

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0106-05

Introduction toMycoplasmagallisepticum

WANG Yu-wei,YUE Hua,ZHANG Xiao-hui,ZHOU Ai-min,LI Ting-jian,MAO Dong-lin,XIAO Long

(MianyangAcademyofAgriculturalSciences,Mianyang,Sichuan,621000,China)

Abstract:Mycoplasma gallisepticum (MG) is the most dangerous pathogen of Mycoplasma in poultry,which mainly cause the Chronic Respiratory Disease(CRD) with the symptom of conjunctivitis,decreased egg production,feed conversion rate and carcasses.MG can be spreaded through the vertical and horizontal transmission in the chicken group,seriously restricting the development of poultry breeding and industrialization each year.In recent years,many researches on the structure and function of protein of MG adhesion (pMGA),PvpA and GapA were did,promoting the development of gene detection technology.With the abuse of antibiotics,drug resistance mutations，QRDRs and other drug resistant structures were also found in MG,with new characteristics in drug resistance.This article mainly focused on the research of drug resistance and detection technology,hoping to provide a theoretical basis for the comprehensive prevention and control of poultry MG.

Key words:Mycoplasma gallisepticum; detection; vaccine; prevention and control; drug resistance