石河子地区奶牛乳房炎大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

张　倩，刘功成，屈勇刚*，赵　毅，杨亚东，杨　蓓，王欣雨 ，王园园

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003;2.陕西省动物疫病预防控制中心,陕西西安 710016)



兽医临床

石河子地区奶牛乳房炎大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

张倩1，刘功成1，屈勇刚1*，赵毅2，杨亚东1，杨蓓1，王欣雨1，王园园1

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003;2.陕西省动物疫病预防控制中心,陕西西安 710016)

摘要：为了解引起新疆石河子地区规模化牛场奶牛乳房炎大肠埃希菌的流行情况及其耐药性，对石河子地区部分奶牛场采集85份临床型或隐性乳房炎奶样进行大肠埃希菌的分离、鉴定及耐药性试验。结果表明，从85份奶样中分离到127株细菌，其中大肠埃希菌27株，占21.26%。耐药性试验结果显示，27株大肠埃希菌全部对杆菌肽耐药，66%以上对青霉素、复方新诺明、红霉素耐药，80%以上对丁胺卡那霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢曲松、头孢哌酮5种药物敏感。调查结果为本地区奶牛乳房炎的防控提供了参考依据。

关键词：奶牛乳房炎；大肠埃希菌；分离鉴定；耐药性

奶牛乳房炎主要是由多种非特定的病原微生物所引起，是奶牛的常见病和多发病，也是影响奶牛业发展及其经济效益的主要疾病之一。奶牛乳房炎的发生除因病原微生物感染外，还与各地区气候环境、畜舍环境、管理措施、奶牛自身及遗传因素等有关[1]。据报道，美国、日本的奶牛隐性乳房炎检出率每年分别达50%和45%，而我国奶牛隐性乳房炎检出率高达50%～70%[2]。大肠埃希菌为引起奶牛乳房炎比较常见的病原菌之一，它不仅感染乳房腺体，还会造成奶牛乳腺组织的损伤或破坏，减少产奶量，甚至会造成乳区泌乳功能的丧失，变成瞎奶区，使奶牛提前淘汰，给奶牛养殖业带来巨大的经济损失[3]。又因乳房炎治疗中抗生素的长期使用致使病原菌对其产生耐药性，从而给奶牛乳房炎的治疗带来困难[4]。因此，及时准确地掌握引起不同地区奶牛乳房炎大肠埃希菌的流行情况及耐药情况，是有效治疗奶牛乳房炎的关键措施[5-6]。本试验通过对新疆石河子地区的奶牛乳房炎大肠埃希菌的分离、鉴定及耐药性分析，为进一步选用有效的抗生素进行治疗提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1奶样临床型乳房炎和隐性乳房炎的奶样采自石河子周边5个不同规模、不同管理水平的奶牛场。采样时，先对乳头进行消毒，弃掉前5 mL～10 mL牛乳后无菌取乳样5 mL左右，冰袋冷藏保存，于24 h内送检。

1.1.2主要试剂及培养基氯化钠(NaCl)、酵母浸粉、牛肉浸粉、柠檬酸钠、蛋白胨、胰蛋白胨、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、硫代硫酸钠、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、酚红、美蓝、伊红Y、溴麝香草酚蓝，北京澳博星生物技术有限公司产品；普通营养琼脂(LB)培养基、伊红美蓝琼脂(EMB)培养基、三糖铁琼脂(TSI) 培养基、生化鉴定培养基(尿素、甲基红(MR)、吲哚、VP、枸橼酸盐、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇培养基)、6%α-萘酚-乙醇溶液、欧-波试剂均由石河子大学动物科技学院传染病实验室常规配制；麦康凯培养基(MAC)，北京奥博星生物科技有限责任公司产品。

1.1.3药敏纸片18种抗菌药物纸片均为杭州微生物试剂有限公司产品，即β-内酰胺类5种：青霉素(PG)、头孢曲松(CTRX)、头孢氨苄(CL)、氨苄西林(AMP)和头孢哌酮(SCF)；氨基糖苷类4种：卡那霉素(K)、庆大毒素(CN)、阿米卡星(AMK)和新霉素(N)；喹诺酮类2种：恩诺沙星(ENR)和氧氟沙星(OFM)；酰胺醇类2种：氯霉素(C)和氟苯尼考(FFC)；多肽类1种：杆菌肽 (B)；大环内酯类1种：红霉素(EM)；四环素类1种：强力霉素(DO)；化学合成类2种：复方新诺明(SXT)和呋喃唑酮(F)。

1.2方法

1.2.1细菌的富集、分离与纯化将采集的85份奶样首先进行病原菌的富集，对85份奶样编号，每份奶样各取100 μL于相应编号的液体LB中进行12 h的摇床培养，然后划线接种到LB培养基上继续培养，挑取形状、大小疑似大肠埃希菌的菌落划线培养于MAC培养基，挑取典型的疑似大肠埃希菌红色菌落涂片，革兰染色，镜检，观察菌体的形态，再次接种到EMB培养基中培养，最后于LB培养基中纯化培养。

1.2.2生化鉴定待检细菌分离纯培养后，杆菌分别接种于三糖铁、尿素、甲基红、吲哚、VP、枸橼酸盐、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇培养基中， 37℃培养观察结果。

1.2.2.1三糖铁试验用接种环挑取少许细菌接种于已制好的三糖铁斜面培养基中，接种时先涂布斜面,后穿刺底层,置37℃恒温箱培养12 h～24 h,观察其反应情况。产酸则培养基变黄；产酸产气则培养基变黄且有气泡；产H2S则培养基底部变黑。

1.2.2.2尿素分解试验将待检细菌接种到尿素斜面琼脂试管中，同时作划线及穿刺接种，37℃恒温培养24 h后观察结果，尿素分解试验阳性者由于产碱而使培养基变为红色(+)；阴性者继续观察4 d仍不变色者为阴性(-)。

1.2.2.3甲基红试验接种细菌于培养液中，37℃恒温培养2 d～5 d，滴加甲基红试剂1滴，立即观察结果。鲜红色为阳性(+)，黄色为阴性(-)。

1.2.2.4吲哚试验挑取小量培养物接种，在37℃培养1 d～2 d，必要时可培养4 d～5 d。加入欧-波试剂约0.5 mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色(+)。

1.2.2.5VP试验 将细菌接种于本培养基中，于37℃培养2 d～4 d。加入6% α萘酚乙醇溶液0.5 mL和400 g/L氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色(+)，如为阴性(-)，则应放在37℃下继续培养过夜再进行观察。

1.2.2.6枸橼酸盐试验将少量被检细菌接种到枸橼酸盐固体斜面培养基上37℃恒温培养2 d～4 d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色(+)。不能利用枸橼酸盐的细菌不能生长,培养基不变色为阴性(-)。

1.2.2.7糖(醇)发酵(分解)试验用接种环取少量被检细菌穿刺接种于糖发酵半固体斜面培养基中，37℃恒温培养2 d～3 d后观察结果。无变化培养基仍为蓝色(-)；产酸培养基变黄(+)；产酸又产气培养基变黄并有气泡(⊕)。

1.2.3分子生物学鉴定

1.2.3.1引物合成参照文献[7]合成大肠埃希菌16 S RNA特异引物，基因序列由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列为：5′-GAGTGGCGGACGGGTGAGTA-3′，5′-GGCTGCTGGCACGGAGTTAG-3′。

1.2.3.2目的基因的PCR扩增PCR反应体系为20 μL：ddH2O 8 μL，Mix混合物8 μL，模板(菌液)2 μL，上游引物(25 pmol/μL)1 μL，下游引物(25 pmol/μL)1 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；最后72℃ 10 min。

1.2.3.3目的条带电泳观察取 PCR 扩增产物 10 μL，于稳压稳流电泳仪上进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，恒压120V，以 DNAMarker DL 2 000 作为参照，于凝胶成像仪上观查并拍照。

1.2.4耐药性试验将纯培养的菌株接种于LB液体培养基中,37℃摇床培养8 h后用移液器吸取100 μL于LB琼脂平板上，用涂布器涂抹均匀静置数分钟使菌液吸收，在无菌条件下将药敏纸片以梅花型贴于平板上，置于37℃温箱培养12 h～48 h，观察并测量抑菌圈大小。

2　结果

2.1菌株的分离与鉴定

菌株在麦康凯上形成红色、圆形、光滑、边缘白色成云雾状的菌落(图1)，革兰染色镜检，可见革兰阴性、红色、两端钝圆的短杆状菌，并在伊红美蓝培养基上形成金属光泽的菌落，结果从采集的85份奶样中分离到27株疑似大肠埃希菌。

2.2生化试验结果

分离出的大肠埃希菌均能在三糖铁斜面上产气产酸但不产H2S且不分解尿素，大多数菌株分解乳糖和葡萄糖(图2)，发酵麦芽糖和甘露醇，吲哚和甲基红试验为阳性(图3、图4)，VP和枸橼酸盐试验为阴性(图5)。

2.3分子生物学鉴定结果

对初步鉴定的大肠埃希菌以37℃过夜培养的菌液为模板进行16 S RNA的PCR鉴定，结果如图6,分离到的27株大肠埃希菌均扩增出了427 bp的特异性目的条带，均表现为16 S RNA的PCR阳性，证实这些菌株为大肠埃希菌。

图1　麦康凯培养基上菌株生长情况

⊕代表产酸又产气；+代表产酸；-代表阴性⊕means producing acid and gas; + means producing acid; - means negative

图2葡萄糖分解情况

Fig.2Decomposition of glucose

+代表阳性；-代表阴性

+ means positive; - means negative

图3甲基红试验鉴定结果

Fig.3The results of methyl red test

+代表阳性；-代表阴性

+代表阳性；-代表阴性

M.DNA标准DL 2 000；1～17.待检菌株

M.DNA Marker DL 2000; 1-17.Strains to be tested

图616 S RNA PCR鉴定结果

Fig.6PCR identification results of 16 S RNA

2.4药敏试验结果

药敏试验结果表明，从石河子地区分离得到的27株大肠埃希菌对每种抗菌药的耐药性差异很大，从0～100%；对杆菌肽、青霉素、红霉素高度耐药，其中27株菌对杆菌肽的耐药率达到100%，对青霉素、红霉素的耐药率分别达到92.59%和81.48%，而分离菌株对头孢曲松、头孢哌酮、阿米卡星、恩诺沙星、氟苯尼考这5种药物的敏感率均在81.40%以上;除此之外,也有一些菌株对强力霉素表现为既不耐受也不敏感(表1)。

3　讨论

本试验从采集的85份奶样中分离出127株细菌，通过形态学观察、生化特性分析及分子生物学方法对其进行鉴定，最终确定分离得到27株大肠埃希菌，占21.26%，说明引起奶牛乳房炎的病原菌并非单一菌而是由多种病原菌引起的，其中金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌为主要致病菌[8]，且大肠埃希菌属于环境性病原微生物，由此可知由于地理环境及饲养管理的不同,引起奶牛乳房炎大肠埃希菌的流行情况及其耐药性有所差异[9-10].及时掌握各地区奶牛乳房炎大肠埃希菌的流行情况及其对抗生素的敏感性，对预防及治疗奶牛乳房炎极其关键。

本试验通过石河子地区奶牛乳房炎大肠埃希菌对18种抗菌药物的敏感性进行分析，结果表明大肠埃希菌对临床上使用的抗菌药物产生了不同程度的耐药性，尤其是对杆菌肽、青霉素、红霉素的耐药率可达80%以上；对头孢曲松、头孢哌酮、恩诺沙星、氟苯尼考、阿米卡星的敏感率可达80%以上。与许丹丹[11]和王礼伟等[12]对石河子地区奶牛乳房炎大肠埃希菌的耐药性分析结果相似，但与吴亚文等[13]对宁夏地区奶牛乳房炎大肠埃希菌的耐药性分析差异较大。

表1　18种抗菌药物对27株大肠埃希菌药敏结果

随着国家农业“十三五”的规划要求，如何发展生态农业，如何加强食品安全保障，成为畜牧兽医工作者不得不思考的问题。鉴于现阶段奶牛乳房炎给畜牧业带来严重经济危害，抗生素治疗带来的副作用，以及病原菌的交叉感染，在用药时可以选择敏感性药物，采取联合用药、轮换用药的方法。同时，还可以采取其他的治疗方法和用药途径，如细胞因子疗法[14]、溶霉素疗法[15]、中药膜剂[16]、中西结合[17]、噬菌体疗法等[18]新型绿色环保防治途径，这是防治奶牛乳房炎新的发展趋势。对本地区奶牛乳房炎的防治除关注治疗的新方法、新动态之外，还应做到以下几点：①提高饲养管理水平，做好牛舍的卫牛清理，改善挤奶技术；②奶牛日粮中合理添加提高机体免疫力的微量元素和维生素等；③用药时要按泌乳期和干乳期分别用药，合理制定用药方案等。只有从生物环境、饲养管理及疫病预防多个角度进行防治，才能减少该病的发病率。

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收稿日期：2016-01-09

基金项目：国家自然科学基金项目(31560699)；新疆生产建设兵团应用基础研究计划项目(2015AG012)；新疆生产建设兵团重点领域科技攻关计划项目(2013AB002)

作者简介：张倩(1990-)，女，河北保定人，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治研究。*通讯作者

中图分类号:S852.612;S857.26

文献标识码:B

文章编号:1007-5038(2016)07-0115-05

Isolation,Identification and Antimicrobial Resistance ofE.coliIsolated from Dairy Cows with Mastitis in Shihezi

ZHANG Qian1,LIU Gong-cheng1,QU Yong-gang1,ZHAO Yi2,YANG Ya-dong1,YANG Bei1,WANG Xin-yu1,WANG Yuan-yuan1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xingjiang，832003,China；2.ShaanxiCentreforAnimalDiseaseControlandPrevention，Xi'an，Shaanxi，710016,China)

Abstract:To investigate the prevalence of E.coli causing mastitis and its antimicrobial resistance in scaled dairy cow farms of Shihezi,Xinjiang,E.coli were isolated,molecular and biochemical identification were made from 85 clinical or subclinical mastitis milk samples collected from some dairy farms in Shihezi,antimicrobial resistances of E.coli were also analyzed.Among the 85 samples,there are 127 strains of bacteria,including 27 strains of E.coli,accounting for 21.26%.Antimicrobial resistance test results showed that 27 strains of E.coli are all resistant to bacitracin,and more than 66% resistant to penicillin,cotrimoxazole,erythromycin,more than 80% are sensitive to amikacin,enrofloxacin,florfenicol,ceftriaxone and cefoperazone.The survey provided theoretical basis for prevention and treatment of dairy cow mastitis.

Key words:dairy cow mastitis; E.coli; isolation and identification; antibiotic resistance