青海省海北地区牦牛源贾第虫检测与基因型分析

王光华，王戈平，李秀萍，蔡其刚，马利青*，周金林

(1.青海省畜牧兽医科学院，青海西宁 810016；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)



青海省海北地区牦牛源贾第虫检测与基因型分析

王光华1，王戈平1，李秀萍1，蔡其刚1，马利青1*，周金林2

(1.青海省畜牧兽医科学院，青海西宁 810016；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241)

摘要：为研究青海省海北地区牦牛贾第虫的感染情况及虫种基因型，对青海省祁连县、海晏县和刚察县的297份牦牛粪样采用蔗糖密度梯度离心法纯化，之后用免疫荧光方法对贾第虫进行鉴定，对阳性及疑似阳性样品采用基于18 S rRNA和谷氨酸脱氢酶(gdh)基因的套式PCR扩增，并对扩增产物进行测序。将测序结果与GenBank中的贾第虫序列进行比对分析。免疫荧光抗体试验结果显示，共检出24份贾第虫阳性粪样，总阴性率为8.1%。套式PCR扩增结果显示,24份阳性样品中18 S rRNA基因扩增阳性22份，gdh基因扩增阳性18份，产物大小分别为292 bp和432 bp。序列分析表明，分离的虫种均为牦牛源肠贾第虫，基因型为集聚体E，未发现人畜共患基因型。

关键词：牦牛；贾第虫；基因型；免疫荧光试验；套式PCR

蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)是一种重要的人兽共患寄生虫，也是人体肠道感染的常见寄生虫之一，常引起人和动物的腹痛、腹泻和消化不良[1]。贾第虫有广泛的宿主，包括人类和其他哺乳动物，一旦感染很难消除。任何年龄的人和动物均有易感性，羔羊和犊牛尤其易感，感染孢囊后多为无症状带虫者，有临床症状者主要表现为急性或慢性腹泻，后者常伴有营养吸收不良综合征。目前，贾第虫病已被列为世界范围内危害人类健康的10种主要寄生虫病之一[2]。

贾第虫的基因型根据分子遗传学和表型不同可分为8个主要的聚集体(A～H),每个聚集体都有不同的宿主范围，A和B集聚体主要感染人和多种哺乳动物[1]。对贾第虫的传统检测方法主要是采集动物粪样浓缩技术(硫酸锌浮集法、甲醛-乙醚沉积法和离心法)处理包囊，之后用ELISA、显微镜观察和免疫荧光技术进行抗原检测。随着分子生物学技术的发展，PCR和荧光定量PCR技术广泛应用于贾第虫的分子流行病学调查。目前，贾第虫的检测和基因分型技术主要通过分析小亚基核糖体RNA(small subunit ribosomal RNA,ssu-rRNA)、β贾第素(β-giardin,bg)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)、延伸因子-1α(elongation factors-1α,ef-1α)、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,tpi)及滋养体表面抗原基因实现[3]。

本研究从青海省海北藏族自治州祁连县、海晏县和刚察县的不同牧户采集了297份牦牛粪样，采用蔗糖密度梯度离心法纯化之后用免疫荧光试验(immunofluorescence test,IFT)进行鉴定，对阳性及疑似阳性样品进行基于贾第虫18 S rRNA和谷氨酸脱氢酶(gdh)的套式PCR扩增，为该地区牦牛贾第虫病的防控和研究提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1粪样2014年9月～11月，分别以青海省祁连县、海晏县和刚察县的7户规模在50头以上的养殖户为调查对象，采集不同牧户4月龄～7月龄犊牦牛的新鲜粪样，加入25 g/L的重铬酸钾溶液后存放于4 ℃冰箱，共采集297份粪便样品。

1.1.2主要试剂与仪器粪样DNA提取试剂盒、GoTaqDNA聚合酶预混液等，Promega公司产品；DNA标准DL 2 000、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、琼脂糖等，宝生物工程(大连)有限公司产品；贾第虫荧光抗体试剂盒，Cellabs公司产品；胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司产品；其他化学试剂如氯化钠、氢氧化钠和碘液等均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1免疫荧光抗体检测参照文献[4]方法，每份样品经蔗糖密度梯度离心法纯化后采用免疫荧光抗体检测法进行检测。在400倍镜下观察，发现贾第虫包囊的样品判为阳性，未发现的判为阴性。

1.2.2粪样DNA的提取对间接免疫荧光试验(IFT)检测阳性的样品提取DNA。分别取400 μL纯化的样品分装于1.5 mL离心管，按粪便DNA提取试剂盒说明书进行样品DNA提取，所得DNA溶于80 μL灭菌水中，置-20 ℃保存备用。

1.2.318 S rRNA基因的套式PCR扩增参照文献[5]的引物和方法对IFT检测阳性样品进行18 S rRNA基因扩增，引物序列见表1，目的基因片段长度约为292 bp。第1轮PCR反应体系为12.5 μL GoTaqDNA聚合酶预混液，上、下游引物Gia2029和Gia2150c各1 μL(10 μmol/L),模板DNA 3 μL，加灭菌水至25 μL；第2轮PCR体系中模板为第1轮PCR反应产物1 μL，上、下游引物RH11和RH4各1 μL(10 μmol/L)，其余试剂与首轮体系一致。第1轮反应条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 7 min。第2轮反应条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物电泳后回收并纯化，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

表1　所用套式PCR引物

1.2.4基于gdh基因的套式PCR扩增参照文献[6]引物和方法对IFT检测阳性样品进行gdh基因扩增，引物序列见表1，目的基因片段长度约为432 bp。第1轮PCR反应体系为12.5 μL GoTaqDNA聚合酶预混液，上、下游引物GDHeF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L),模板DNA3 μL，加灭菌水至25 μL；第2轮PCR体系中模板为第1轮PCR反应产物1 μL，上、下游引物GDHiF和GDHiR各1 μL(10 μmol/L)，其余试剂与首轮反应体系一致。第1轮反应条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min。第2轮反应条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；之后72 ℃ 7 min。PCR产物电泳后回收并纯化，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.5基于gdh基因的限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析参照文献[6]的方法，将PCR扩增的gdh基因片段采用限制性内切酶NlaⅣ进行RFLP分析，具体步骤为：10×M buffer 2 μL,限制性内切酶NlaⅣ 0.5 μL，PCR产物10 μL，牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)0.2 μL，加灭菌水至20 μL。37 ℃反应3 h,之后采用30 g/L琼脂糖凝胶电泳，核酸染色剂染色后分析电泳图谱。

2　结果

2.1粪样免疫荧光抗体检测

经贾第虫免疫荧光抗体试剂盒检测，在采集的297份粪样中共检出24份贾第虫阳性样品，总感染率为8.1%。贾第虫在免疫荧光显微镜下的形态见图1。

图1　免疫荧光抗体法检测牦牛贾第虫包囊(400×)

2.218 S rRNA基因和gdh基因扩增结果

24份IFT阳性样品采用套式PCR方法扩增，18 S rRNA基因扩增阳性22份，gdh基因扩增阳性18份，产物大小分别为292 bp和432 bp，符合预期大小(图2和图3)。

2.3基因测序及序列分析

将扩增出的PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，经NCBI Blast序列比对，结果均为贾第虫18 S rRNA基因或gdh基因。

2.4RFLP分析结果

将PCR扩增的gdh基因片段采用限制性内切酶NlaⅣ进行RFLP分析，发现gdh基因片段可以被限制性内切酶(NlaⅣ)酶切为3个主要的片段为220、100、70bp(图4)。这个结果与文献[6]中贾第虫集聚体E型的片段大小一致。

3　讨论

本研究采用免疫荧光抗体试验对青海省海北州

M.DNA标准DL 2 000；1.阳性对照;2.阴性对照；3～17.粪样PCR结果

M.DNA标准DL 2 000；1.阳性对照；2～9.粪样PCR结果；10.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 00;1.Positive control.2-9.PCR products of the fecal samples;10.Negative control

图3贾第虫gdh基因PCR扩增结果

Fig.3PCR amplification results ofGiardiagdh gene

M.DNA标准；1～2.粪样gdh 基因PCR-RFLP分析结果；3.阳性对照样品gdh 基因PCR-RFLP分析结果；4.阴性对照

M.DNA Marker；1-2.PCR-RFLP analysis of positive samples；3.PCR-RFLP analysis of positive control；4.Negative control

图4基于贾第虫gdh基因的PCR-RFLP分析图

Fig.4PCR-RFLP analysis ofGiardiagdh gene

部分地区的牦牛粪样进行了贾第虫的鉴定，从297份粪样中共检出24份贾第虫阳性样品，总感染率为8.1%。表明该地区牦牛中存在一定程度的贾第虫感染。不同地区，不同动物中贾第虫的感染率不同，冯超等[7]对河南省2 137份奶牛粪样调查发现189份奶牛粪样为贾第虫阳性，总感染率为8.84%。顾有方等[8]对安徽省部分地区山羊粪样进行贾第虫鉴定，共检出32份贾第虫阳性样品，总阳性率为6.3%。王光华等[9]对青海省海晏县10份牧羊犬粪便样品进行贾第虫检测，结果有1份为贾第虫包囊阳性，阳性率为10%。

IFT方法操作简单，特异性好，但仅凭形态学和免疫学鉴定难以确定基因型和亚型，通过分子生物学方法进行基因分型可以弥补形态学分类的不足。基于贾第虫18 S rRNA基因的套式PCR扩增是目前最常用的方法之一，该方法具有简便、快速、特异性和敏感性强等特点。在本试验中用18 S rRNA基因套式PCR方法共检测出22份贾第虫阳性样品，出现部分样品IFT检测阳性而PCR检测阴性现象，可能是由于贾第虫包囊在样品中分布不均匀或样品中存在PCR扩增酶抑制物。

在贾第虫聚集体分型方面主要采用基于18 S rRNA和gdh基因PCR-RFLP分析方法，但由于18 S rRNA比gdh基因更加保守，因此采用18 S rRNA PCR-RFLP方法无法区分集聚体A和B中存在的亚型；此外，PCR-RFLP分析中采用的gdh基因片段比18 S rRNA基因片段长，因此分析获得的信息更加可靠[6]。本试验中对阳性样品采用基于贾第虫gdh基因的PCR-RFLP分析方法，结果表明阳性样品均为牦牛源肠贾第虫，基因型为集聚体E，没有发现人畜共患的集聚体。

参考文献：

[1]邓明俊,肖西志,孙涛,等.蓝氏贾第鞭毛虫检测技术研究进展[J].动物医学进展,2012,33(12):168-173.

[2]张会宁,于鑫,魏博,等.隐孢子虫和贾第鞭毛虫的危害及其控制技术[J].环境科学与技术,2011,34(12):135-140.

[3]梁乐,汪世龙,王惠琴.水源性蓝氏贾第鞭毛虫分子生物学检测方法研究进展[J].国际医学寄生虫病杂志,2009,36(2):114-117.

[4]Ma L Q,Isaia S,Cai Q G et al.Detection ofCryptosporidiumandGiardiain agricultural and water environments in the Qinghai area of China by IFT and PCR [J].Parasitol Res,2014,113:3177-3184.

[5]Juan D R,Ruben D H,Carolina H,et al.Molecular diagnosis and genotype analysis ofGiardiaduodenalisin asymptomatic children from a rural area in central Colombia [J].Infect Genet Evol,2015,32:208-213.

[6]Carolyn M R,Paul T M,Andrew Thompson R C.Discrimination of all genotypes ofGiardiaduodenalisat the glutamate dehydrogenase locus using PCR-RFLP [J].Infec Genet Evol,2004,4:125-130.

[7]冯超.河南省部分地区奶牛贾第虫病流行病学调查及分离株分子特征研究[D].河南郑州：河南农业大学,2010.

[8]顾有方,王立克,李阳,等.安徽省部分地区山羊蓝氏贾第鞭毛虫流行病学调查及基因型分析[J].中国寄生虫与寄生虫病杂志,2014,32(5):401-403.

[9]王光华,蔡其刚,王戈平,等.青海省海晏县犬粪样中贾第鞭毛虫的检测[J].动物医学进展,2013,34(9):29-32.

收稿日期：2016-01-19

基金项目：青海省自然科学基金项目(2013-Z-934Q)；外专千人计划(WQ20136300172)

作者简介：王光华(1978-)，男，青海大通人，副研究员，博士，主要从事病原微生物学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.722

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0030-04

Detection and Genotyping ofGiardiaIsolates from Yaks in Haibei Area of Qinghai Province

WANG Guang-hua1,WANG Ge-ping1,LI Xiu-ping1,CAI Qi-gang1,MA Li-qing1,ZHOU Jin-lin2

(1.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,Xining,Qinghai,810016，China; 2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Shanghai,200241，China)

Abstract:Two hundred ninety-seven fresh fecal samples were collected from yaks in Qilian,Haiyan,Gangcha counties of Qinghai province,and detected by immunofluorescence test (IFT) after discontinuous sucrose gradient purification.The IFT-positive samples were amplified by nested PCR targeting the 18 S rRNA and glutamate dehydrogenase (gdh) genes,and the positive PCR products were sequenced.The sequencing results and published Giardia sequence in GenBank were compared and analyzed.The results showed,24 fecal samples were positive by IFT,the total infection rate was 8.1%.22 out of 24 were 18 S rRNA gene (292 bp) positive,18 out of 24 were gdh gene (432 bp) positive,respectively.The sequence analysis indicated that these isolated species are Giardia duodenalis,assemblage E.The zoonotic genotype was not found in the present study.

Key words:yak; Giardia; genotype; immunofluorescence; nested-PCR