祛脂三味方对非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化应激的影响

郑册　陶然　张琴



祛脂三味方对非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化应激的影响

郑册陶然张琴

目的探索祛脂三味方(QZSWF)对非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化应激的影响及机理。方法SD雄性大鼠，通过连续5周高脂饮食建立脂肪肝模型，考察中药祛脂三味方连续给药4周后对非酒精性脂肪性肝病大鼠血脂和氧化应激的影响。结果祛脂三味方组与模型组比较低密度脂蛋白(LDL)明显降低(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义；祛脂三味方组与模型组比较还原型谷胱甘肽(GSH)显著升高(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义；各组大鼠体重变化和各组肝脏重量差异无统计学意义(P>0.05)。大体标本显示，祛脂三味方组与模型组以局灶型脂肪变为主，偶见弥漫性脂肪变；病理切片示祛脂三味方组肝脏脂肪变细胞向汇管区以放射状排列。结论祛脂三味方具有降血脂和抗氧化作用，其机理主要是通过降低LDL、升高还原型谷胱甘肽(GSH)。

脂肪肝；血脂；氧化应激；祛脂三味方

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指以无过量饮酒史的肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合诊断，包括非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[1]。NASH是NAFLD的进展形式，可发展为肝硬化，并且会增加肝细胞癌的风险[2]。NAFLD已经成为发达国家最常见的慢性肝病[3]，过去20 年其他慢性肝病的发病率呈下降趋势，而NAFLD 的发病率却逐渐增加，甚至翻番[4]。脂肪肝在我国已经取代慢性肝炎成为第一大肝脏疾病[5]。

NASH 致病的确切机制尚未明确，目前最广泛接受的理论是1998年Day et al[6]提出的“二次打击”学说。胰岛素抵抗是其发生发展的核心环节，脂质代谢异常是始动因子[7]，当机体出现胰岛素抵抗(IR)时，体内游离脂肪酸(FFA)大量增多，发生“一次打击”；反应性氧化代谢产物引发氧化应激则为二次打击[8]。脂质过氧化是氧化应激的主要机制，氧化应激是NAFLD进展到NASH的中心环节[9-10]，并且氧化应激在其脂肪变早期就可能已经存在[11]。中医药在治疗脂肪肝和降血脂方面具有独特的疗效，近年国内外的相关研究从不同方面积累了一定的成果。我们根据临床经验结合中医理论，提出“土壅木郁”假说，故拟定中药祛脂三味方(山楂、决明子、虎杖)治疗本病。前期临床和基础研究都证明了，祛脂三味方(QZSWF)对NASH具有肝功能复常、调节血脂的临床功效[12-14]。故在此基础上，研究本方对NAFLD大鼠血脂和氧化应激的影响及作用机理。

资料和方法

一、实验动物与试剂

清洁级SD雄性大鼠18只，8周龄，体重160 g±20 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)试剂盒，编号S0053；总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)，编号S0101；脂质氧化(MDA)检测试剂盒，编号S0131，均购自碧云天生物技术。游离脂肪酸(NEFA)检测试剂盒，货号A042，购自南京建成生物技术。大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒，购自上海西塘生物科技有限公司。所有指标检测都按照说明书执行。

二、试验方法

(一)动物造模所有动物饲养于清洁级环境。适应性喂养1周后，随机分为3组，每组6只，所有动物自由进食进水。正常组给予常规大鼠饲料；模型组、祛脂三味方治疗组均饲以高脂饲料(各营养成分供能比例为蛋白质18%,脂肪45%，碳水化合物37%)，每周记录体重变化和饲料重量变化1次。

(二)给药方法祛脂三味方给药剂量：生山楂30，决明子30，虎杖20，按亚洲成人体重60 kg计算，成人每天剂量为1.3333 g生药/kg体重，则动物(大鼠剂量)给药如下：1.3333 g/kg 6.25=8.3331 g/kg，按照20 mL/kg的给药容积给药，药品配置浓度为0.4167 g 生药/mL。

可以此为中剂量，等比设置高中低剂量组。饲养5周后，从第6周起每天固定时间给予祛脂三味方灌胃1次，连续给药4周，给药前称量并做记录。祛脂三味方用0.5%羟甲基纤维素钠(CMC)溶媒配置浓度0.6 g/mL溶液，现用现配，以10 mL/kg实验剂量，正常组和模型组给予相应体积的0.5% CMC灌胃。

(三)标本检测连续治疗4周，末次给药后，禁食12 h，不禁水，称重后，氯胺酮麻醉，进行腹主动脉采血。采集血液静置20 min后，5000 rpm，15 min离心，取上清，检测肝功能。随后完整摘取肝脏，生理盐水冲洗血渍后，肉眼观察肝脏色泽、质地，并拍照记录大体外观，随后进行称重，记录肝脏重量。随后剪取肝脏左侧叶置于福尔马林溶液中固定；剪取肝脏右中叶，切取3～5 mm厚度均匀的肝脏组织，冻存于OCT包埋剂中，液氮冻存；剩余肝脏组织冻存于-80℃待测，用于MDA、GSH、SOD、FFA、TNF-α等指标检测。

三、统计学分析

结　　果

一、祛脂三味方对NAFLD大鼠体重和肝脏重量的影响

各组大鼠体重变化和各组肝脏重量差异无统计学意义(P>0.05)，说明中药袪脂三味方对大鼠的体重和肝脏重量改变不明显(见表1)。

表1　大鼠肝脏数值

二、祛脂三味方对NAFLD大鼠肝脏脂肪分布的影响

模型组和祛脂三味方组较正常组肝脏脂肪明显增多，说明脂肪肝模型成功。大体标本显示，祛脂三味方组与模型组以局灶型脂肪变为主，偶见弥漫性脂肪变，组间比较肝脏脂肪含量差异不明显(以脂肪变面积计算)。病理标本显示，祛脂三味方组与模型组脂肪总量差异不明显，脂肪分布情况有差异，模型组脂肪泡分布散乱不规则，祛脂三味方组脂肪分布较规则，向汇管区集中。结果说明，祛脂三味方能够改变脂肪肝大鼠的肝脏脂肪分布，其机制有待进一步探索(见图1和图2)。

三、祛脂三味方能够降低单纯性脂肪肝大鼠血脂，且以降低LDL为主。

各组大鼠血清生化学指标，结果以平均值代表各组，标准差(SD)表示误差。分析肝损害指标(见表2)，分析糖脂代谢指标(见表3)。结果表明，NAFLD大鼠模型的肝功能损害及血脂升高不明显，以ALP、TBil升高为主，血脂升高以TC、TG为主；袪脂三味方对NAFLD大鼠的轻度肝损害作用不显著，对血脂影响以降低LDL为主。

注：模型组较正常组肝脏脂肪明显增多；祛脂三味方组与模型组以局灶性脂肪变为主，组间肝脏脂肪含量差异不显著(以脂肪变面积计算)

注：正常组与模型组差异显著；祛脂三味方组与模型组脂肪总量差异不明显，脂肪分布有差异，模型组脂肪分布散乱不规则，祛脂三味方组脂肪分布较规则，以反射状向汇管区集中

图2　各组大鼠肝脏病理组织

注：*表示与正常组比较有差异，#表示与模型组比较有差异。ALT，祛脂三味方组对模型组(P=0.186>0.05),模型组对正常组(P=0.405>0.05)；AST，祛脂三味方组对模型组(P=0.609>0.05),模型组对正常组(P=0.222>0.05)；ALP，祛脂三味方组对模型组(P=0.096>0.05),模型组对正常组(*P=0.013<0.05)；TBil，祛脂三味方组对模型组(P=0.062>0.05),模型组对正常组(*P=0.04<0.05)；TBA，祛脂三味方组对模型组(P=0.513>0.05),模型组对正常组(P=0.845>0.05)。

表3　血糖血脂的影响(±s)

注：*表示与正常组比较有差异，#表示与模型组比较有差异。血糖(GLU)，祛脂三味方组对模型组(P=0.708>0.05),模型组对正常组(P=0.376>0.05)；胆固醇(TC)，祛脂三味方组对模型组(P=0.138>0.05),模型组对正常组(*P=0.019<0.05)；甘油三酯(TG)，祛脂三味方组对模型组(P=0.618>0.05)，模型组对正常组(*P=0.027<0.05)；低密度脂蛋白(LDL)，祛脂三味方组对模型组(*P=0.036<0.05)；模型组对正常组(P=0.109>0.05)；高密度脂蛋白(HDL)，祛脂三味方组对模型组(P=0.113>0.05)，模型组对正常组(P=0.024<0.05)；游离脂肪酸(FFA)，祛脂三味方组对模型组(P=0.392>0.05)，模型组对正常组(P=0.179>0.05)。

四、祛脂三味方对非酒精性脂肪肝大鼠MDA、SOD、GSH、GSSG、TNF-α的影响

模型组与正常组比较，祛脂三味方组与模型组比较，各组冰丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、肿瘤坏死因子(TNF-α)结果见表4，差异有统计学意义。

表4　大鼠肝脏组织氧化指标(±s)

注：*表示与正常组比较有差异，#表示与模型组比较有差异。丙二醛(MDA)，祛脂三味方组对模型组(P=0.734>0.05),模型组对正常组(*P=0.011<0.05)；超氧化物歧化酶(SOD)，祛脂三味方组对模型组(P=0.892>0.05),模型组对正常组(*P=0.001<0.05)；还原型谷胱甘肽(GSH)，祛脂三味方组对模型组(#P=0.001<0.05),模型组对正常组(P=0.463>0.05)；氧化型谷胱甘肽(GSSG)，祛脂三味方组对模型组(#P=0.001<0.05),模型组对正常组(P=0.579>0.05)；肿瘤坏死因子(TNF-α)，祛脂三味方组对模型组(P=0.368>0.05),模型组对正常组(P=0.78>0.05)。

讨　　论

基于多年的临床经验，研究者提出脂肪肝“土壅木郁”的病机假说[15]，并且运用祛脂三味方来“消土壅”、“解木郁”。祛脂三味方由山楂、决明子、虎杖组成，山楂酸、甘，微温，归脾、胃、肝经，有消食化积、活血散瘀之力; 决明子甘、苦，微寒，归肝、大肠经，取清肝明目、润肠通便之用; 虎杖苦、寒，归肝、胆、肺经，收清热利湿、活血化瘀之功。故山楂配决明子以“消土壅”证；山楂配虎杖以“解木郁”；以“消土壅”和/或“解木郁”即健脾解郁、疏肝利胆。

脂质代谢紊乱和氧化应激损伤是NASH发生发展的重要机制。实验结果表明，祛脂三味方能显著降低LDL,说明袪脂三味方的降血脂作用具有重要临床意义。氧化应激是NAFLD进展到NASH的中心环节[9]。近年观察表明，氧化应激在NAFLD脂肪变早期就可能存在。当机体出现IR时，FFA大量增多，导致肝细胞脂肪变性，产生大量活性氧簇(ROS)[16]。GSH是ROS清除酶的还原底物，反应生成的GSSG具有高细胞毒素[17]。当细胞内以GSH为主的抗氧化系统未能及时清除ROS时，便产生氧化应激，形成脂质过氧化物，即MDA，引起蛋白及核酸损伤，导致肝细胞损伤死亡。SOD可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。TNF-α源于单核巨噬细胞，是慢性肝脏损伤重要的细胞因子，其表达与机体脂肪含量平行[18]。结果显示，模型组仅有保护因子SOD降低，说明SOD较早出现异常，其余指标可能尚处于代偿范围，甚至损伤因子MDA亦降低，原因未知。祛脂三味方组抗氧化因子GSH显著升高，FFA、SOD、MDA、TNF-α变化不显著，说明祛脂三味方具有抗氧化作用，以升高GSH为主，因此证明祛脂三味方的抗氧化作用具有重要的临床意义，但是同时有害因子GSSG升高，其原因和机理有待进一步探索。

综合试验结果，说明祛脂三味方具有控制大鼠体重增加、改变肝脏脂肪分布，并且具有抗氧化作用和降血脂的作用，尤其是降低LDL、升高GSH，值得进一步完善研究其药效学方案及探讨更有意义的临床研究价值。

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(本文编辑：易玲)

2016-04-05)

上海市中医药三年行动计划项目(ZY3-CCC-3-3035)；上海市优秀适宜技术项目(2013SY072)

200336上海上海交通大学医学院附属同仁医院感染科

张琴，Email：zhangq1030@163.com