细胞周期激酶亚单位1对肝细胞癌细胞增殖能力的影响

金宇霆　张江　武昊宇　夏强



细胞周期激酶亚单位1对肝细胞癌细胞增殖能力的影响

金宇霆张江武昊宇夏强

目的观察细胞周期激酶亚单位1(CKS1)在肝细胞癌及正常肝组织中的表达以及其对人肝细胞癌细胞BEL-7405的增殖能力的影响。方法应用免疫组织化学检测65对手术肝细胞癌组织及癌旁正常组织CKS1的表达水平。应用Western印迹检测肝癌细胞系与正常肝脏细胞中CKS1表达量的差异。应用小干扰RNA(siRNA)技术转染肝细胞癌BEL-7405细胞，Western印迹检测CKS1 siRNA对CKS1蛋白的干扰效果，同时应用细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆增殖实验检测CKS1对BEL-7405细胞增殖能力的影响。结果免疫组织化学染色结果显示，CKS1在正常肝组织中表达量较肝细胞癌组织中表达量低，且差异有统计学意义(P<0.05)。Western印迹检测表明CKS1在7种肝细胞癌细胞系表达量显著高于正常肝细胞株，且CKS1的表达量在肝细胞癌BEL-7405细胞株显著高于其他肝癌细胞株。CCK-8法检测CKS1的siRNA转染BEL-7405细胞与阴性对照组和空白对照组相比明显抑制细胞增殖，在48、72和96 hA值分别降低了0.376、0.566、0.972(P<0.05)；平板克隆增殖形成实验表明，CKS1的siRNA转染BEL-7405细胞后肿瘤细胞形成的克隆增殖集落明显少于阴性对照组和空白组,干扰组与空白、阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论CKS1在肝细胞癌组织中表达量显著高于正常肝组织，在肝癌细胞中表达量显著高于正常肝细胞， CKS1在肝细胞癌细胞BEL-7405的增殖中扮演了重要的角色，CKS1可能成为针对肝细胞癌基因治疗的新兴靶点。

肝细胞癌； 细胞周期激酶亚单位1； siRNA干扰；细胞增殖

研究表明，肿瘤的发生、发展与细胞周期紊乱密切相关，细胞周期激酶亚单位(Cyclin kinase subunit，CKS)家族蛋白是真核生物在进化中相对保守的小分子蛋白，高等真核生物表达CKS1和CKS2两种蛋白，该蛋白与细胞周期功能相关[1]。CKS家族蛋白通过影响S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的活性，导致肿瘤抑制蛋白p27泛素化，结合CKS1蛋白促进增殖分化、抗凋亡[2-5]，可能也参与了恶性肿瘤的发生、进展过程。本研究采用免疫组织化学技术和Western印迹法检测HCC组织和细胞与正常肝脏组织和肝细胞的表达分布，同时应用体外化学合成的CKS1 siRNA转染人HCC细胞BEL-7405，探讨其对HCC增殖能力的影响及其作用机制。

资料和方法

一、主要材料和试剂

HCC组织取自上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科2013年3月至2014年2月手术切除HCC标本共65对，包括HCC组织，以及癌旁肝脏组织(距癌组织边缘2 cm)。65例HCC患者中男43例，女22例，年龄36～69岁，中位年龄49岁。所有标本经2名病理科资深医师证实为原发性HCC，患者均签署知情同意书，术前均未接受放疗、化疗和其他药物治疗。兔抗人CKS1抗体购自美国Abcam公司，人HCC细胞株HepG2、QGY-7703、BEL-7405、SMMC-7721、PLC、MHCC-97L、MHCC-97H以及人正常肝脏细胞株HL-7702购自中国科学院细胞库，DMEM培养液(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，siRNA-CKS1质粒(上海吉玛公司)，GAPDH抗体购自美国Santa-cruz公司，蛋白提取试剂盒购自北京普利莱公司。

二、方法

(一) 免疫组织化学检测脱蜡水化；抗原修复；封闭内源性过氧化物酶，滴加一抗，CKS1抗体(1∶100)；滴加聚合物增强剂(试剂A)，滴加酶抗鼠/兔聚合物(试剂B)，DAB显色；苏木素复染、返蓝；脱水透明，树胶封片；结果判定标准：阳性细胞为浅黄或棕褐色；阳性细胞数>5%判为阳性。

(二) 细胞培养及分组人HCC细胞株HepG2、QGY-7703、BEL-7405、SMMC-7721、PLC、MHCC-97L、MHCC-97H以及人正常肝脏细胞株HL-7702均用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，37℃，体积分数为0.05的CO2孵箱培养。3组分别为干扰组、阴性对照组和空白组，实验所有指标的检测均按照以下分组：CKS1 siRNA组、阴性对照组(NC),空白对照组。

(三) siRNA转染BEL-7405细胞处于50%～70%融合时CKS1 siRNA、NC组分别转染，并严格按照LipofectamineTM2000(美国Invitrogene公司)转染试剂盒说明书操作。并取对数生长期细胞进行实验。

(四) Western印迹检测肿瘤细胞和正常肝癌细胞HL-7702的CKS1蛋白表达水平以及BEL-7405细胞质粒干扰后CKS1蛋白的表达水平提取总蛋白；加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸变性；通过分离，转至硝酸纤维素膜上，加入一抗CKS1和GAPDH抗体，4℃孵育过夜；加入二抗，室温下孵育2 h；然后用奥德赛红外激光成像系统扫描条带显色。结果用Image J进行灰度值分析。

(五)细胞计数试剂盒(CCK-8)检测BEL-7405细胞增殖取转染后细胞，每孔铺2×107/L细胞、每组设5个复孔，每孔加含10%胎牛血清的DMEM完全培养基200 μL；置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中分别培养24、48、72、96 h ；每复孔加入无血清培养基100 μL，CCK-8溶液10 μL，空白对照孔只加等量无血清培养基和CCK-8溶液；放入培养液继续孵育0.5、1.0、2.0、4.0 h；酶标仪测定450 nm波长下的吸光度(A)值。

(六)克隆形成实验野生BEL-7405细胞，siRNA干扰BEL-7405细胞，NC处理BEl-7405细胞接种到6孔板，每个孔1×1 000个细胞，培养10 d。细胞克隆与10%甲醛混合10 min，用1.0%龙胆紫染色5 min。数码相机拍照，计数克隆数目(>50个细胞/克隆)。

三、统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、免疫组织化学检测CKS1在HCC癌组织以及癌旁组织中的表达情况

CKS1的表达量在癌旁组织及HCC癌组织中均有表达，而在HCC癌组织中表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=26.365,P<0.05)。见表1，图1。

二、Western印迹检测CKS1蛋白在不同HCC细胞株及正常肝细胞株中的表达

CKS1在不同HCC细胞株中的表达量不一致，但均高于正常肝脏细胞HL-7702，其中CKS1蛋白在BEL-7405细胞中的表达量最高(图2)。

注：A. HCC癌旁组织；B. 肝细胞癌组织

组别份数阳性(+)中等阳性(++)强阳性(+++)HCC癌旁组织65321815HCC癌组织 65141635

注：CKS1为细胞周期激酶亚单位1

注：CKS1为细胞周期激酶亚单位1。1～7为HCC细胞系：7703，7721，HepG2，7405，PLC，97L，97H；8为人正常肝细胞株7702

图2Western印迹检测CKS1在HCC及人正常肝脏细胞株中表达

三、siRNA干扰BEL-7405细胞之后，CKS1蛋白表达量变化

图3siRNA干扰BEL-7405细胞后，CKS1蛋白的表达情况

使用siRNA处理BEL-7405细胞株之后，siRNA组的CKS1蛋白表达量相较阴性对照组及空白组下明显(图3)，表明siRNA表达载体转染成功，可明显注：CKS1为细胞周期激酶亚单位1；Mock为空白对照组；NC为阴性对照组；Knockdown为siRNA敲低组；siRNA敲低组与NC组和MOCK组比较，P<0.05降低CKS1基因的表达水平。

四、CCK-8实验结果

经CKS1 siRNA处理后，HCC细胞株BEL-7405的增殖能力较空白对照组和NC组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

五、克隆平板实验结果

经CKS1 siRNA处理后，HCC细胞株BEL-7405的克隆增殖形成能力像较空白对照组和NC减少明显，见图4。

注：NC为阴性对照组；Knockdown为siRNA敲低组

组别0h24h48h72h96hMock0.312±0.0320.511±0.0411.217±0.0561.575±0.0682.211±0.088NC0.321±0.0270.532±0.0371.257±0.0621.622±0.0712.575±0.104Knockdown0.299±0.0460.431±0.0290.875±0.0421.025±0.0531.212±0.071

注：Mock为空白对照组；NC为阴性对照组；Knockdown为siRNA敲低组。siRNA敲低组与NC组和MOCK组比较，P<0.05

讨　　论

肿瘤的发生、发展与细胞周期紊乱密切相关，细胞周期调控的核心是一组细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases，CDK)[6，7]。CDK的时相性激活与失活分别受到细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CKI)的调控。p27kip1蛋白即是属于CKI中的一种，它可通过抑制Cyclin-Cdk/CDK的活性来调控细胞周期[8，9]。p27kip1在原发性肝癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤中呈低表达状态，而且与肿瘤的恶性程度和预后相关。CKS1是高度保守的细胞周期调节蛋白，CkS家族蛋白通过S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的活性，使肿瘤抑制蛋白p27泛素化，导致肿瘤抑制蛋白p27活性产生变化，导致其抑癌作用变化，从而促进肿瘤细胞增殖分化、使其凋亡下降[10]。

本研究结果显示，CKS1蛋白在HCC中表达并定位于细胞核，在HCC癌组织中其表达量明显高于癌旁组织。Western印迹实验进一步在细胞水平验证了相似的结果，CKS1蛋白在肝细胞癌细胞系中表达量显著高于正常肝细胞。因此，推测CKS1在HCC肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色。通过Western印迹技术检测其干扰效率，结果显示siRNA有效干扰了CKS1基因的表达。采用CCK-8法检测，发现siRNA干扰后的细胞株的增殖能力明显下降，而阴性对照组和空白对照组间差距不大，且显著高于干扰组。克隆平板形成实验证实，siRNA干扰处理之后的BEL-7405细胞克隆增殖集落形成能力显著低于阴性对照组及空白对照组。这也从细胞功能层面上证实了下调CKS1基因之后，细胞增殖能力产生了显著下降。

本研究表明，CKS1基因显著高表达于HCC肿瘤组织中，同时促进HCC细胞株BEL-7405的增殖能力，同时应用siRNA干扰技术可有效抑制CKS1基因的表达，使细胞增殖能力显著降低。为HCC发病的基因学研究提供了新的思路。

[1]Kim JY, Kim HJ, Park JH, et al. Epidermal growth factor upregulates Skp2/Cks1 and p27(kip1) in human extrahepatic cholangiocarcinoma cells. World J Gastroenterol，2014，20:755-773.

[2]Khattar V, Thottassery JV. Cks1: Structure, Emerging Roles and Implications in Multiple Cancers. J Cancer Ther， 2013，4:1341-1354.

[3]Liu Z, Fu Q, Lv J, et al. Prognostic implication of p27Kip1, Skp2 and Cks1 expression in renal cell carcinoma: a tissue microarray study. J Exp Clin Cancer Res, 2008，27:51.

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[5]Yang C, Nan H, Ma J, et al. High Skp2/Low p57(Kip2) expression is associated with poor prognosis in human breast carcinoma. Breast Cancer，2015，9:13-21.

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[7]Gutierrez-Escribano P, Nurse P. A single cyclin-CDK complex is sufficient for both mitotic and meiotic progression in fission yeast. Nat Commun，2015，6:6871.

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[10]Zhang Q, Hou D, Luo Z, et al. The novel protective role of P27 in MLN4924-treated gastric cancer cells. Cell Death Dis，2015，6:e1867.

(本文编辑：钱燕)

Effect of cyclin dependent kinase submit 1 on proliferation of hepatocellular carcinoma(HCC) BEL-7405 cells

JINYu-ting,ZHANGJiang,WUHao-yu,XIAQiang.

Desect1mentofLiverSurgery,RenJiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,ChinaCorrespondingauthor:XIAQiang,Email:xiaqiang@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of cyclin dependent kinase submit 1 (CKS1) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its effect on the proliferation of HCC cell line, BEL-7405. MethodsThe expression of CKS1 in 65 pairs of HCC tissues and normal tissues was measured by immunohistochemistry (IHC). Meanwhile, the expression of CKS1 in 7 different HCC cell lines and normal liver cell line was analyzed by western blot. Furthermore, a small interfering RNA (siRNA) targeting CKS1 was constructed and transfected into human HCC cells BEL-7405. The effects of CKS1 knockdown on cell proliferation and gene expression were assessed by CCK-8 assay, tablet cloning assay and western blot analysis, respectively. ResultsCKS1 expression was extremely higher in HCC tissue than that in normal liver tissue (P<0.05). Proliferation of siRNA-transfected BEl-7405 cells (siRNA-transfected group) was extremely inhibited comparing to that of negative control or blank group (P<0.05). ConclusionThe expression of CKS1 in HCC tissues and cell lines was significantly higher than that normal liver tissue or cell line, respectively. Additionally, CKS1 plays an important role in proliferation of BEL-7405 HCC cell lines, which might be a novel anti-tumor target for HCC.

HCC; CKS1; siRNA; Cell proliferation

2016-03-02)

国家自然基金项目(81472243)

200127上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科

夏强，Email：xiaqiang@medmail.com.cn