大脑中动脉栓塞大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的变化规律

吴相春　王少卿　唐　璐　朱文浩　高　颖

(北京中医药大学东直门医院神经内科，北京　100700)



大脑中动脉栓塞大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的变化规律

吴相春王少卿唐璐朱文浩高颖

(北京中医药大学东直门医院神经内科，北京100700)

目的探讨大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴变化规律。方法SD大鼠70只随机分为正常组、假手术组、手术组，假手术组与手术组按不同时间分为6 h、48 h、72 h组，每组10只。以大脑中动脉栓塞法建立MCAO大鼠模型，分别在手术完成后6 h、48 h、72 h腹主动脉取血，放射免疫法检测大鼠血浆促肾上腺皮质素释放激素(CRH)、血清促肾上腺皮质激素(ACTH)和血清皮质酮(CORT)的水平。结果与假手术组比较，MCAO大鼠在3 h时血浆CRH，血清ACTH、CORT增高，在48 h、72 h时血浆CRH，血清ACTH降低，血清CORT水平进一步增高。结论MCAO大鼠存在明显的HAP轴功能紊乱，调节紊乱的HPA轴功能可能为脑血管疾病的防治提供新的途径。

大脑中动脉栓塞；下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴

下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴是机体神经内分泌系统重要的组成部分，在脑血管疾病中起重要作用，影响缺血性脑血管疾病的发病及长期预后〔1～5〕，大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型是缺血性脑卒中研究的常用模型〔6〕，本研究探讨MCAO模型大鼠HPA轴变化规律。

1　材料与方法

1.1动物健康清洁级雄性SD大鼠70只，体质量280～300 g，由北京华阜康生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2009-0007。饲养于北京东直门医院中医脑病研究室动物房，光照12 h/d，温度20℃～23℃，相对湿度40%～60%。正常饲料饮食，保持充足的饮水。

1.2试剂促肾上腺皮质激素(ACTH)、人促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、肾上腺皮质酮(CORT)放射免疫分析试剂盒，由北京北方生物技术研究所提供。MCAO栓线(A4级)由北京沙东生物技术有限公司提供。

1.3方法

1.3.1实验分组将70只SD雄性大鼠按体质量随机分为手术组、假手术组、正常组，其中假手术组和手术组按照3个时点分为3个亚组：缺血6 h、48 h、72 h组，每个亚组10只。正常组10只。

1.3.2模型制作手术组动物采用大脑中动脉线栓法制备MCAO动物模型，参照Longa 线栓法〔6〕的基础上，加以改良，大鼠以3.5%的水合氯醛以10 ml/kg麻醉成功后，仰卧固定，颈部正中切口1.5～2 cm，钝性分离肌肉，以开睑器暴露手术野，分离左侧颈总动脉(CCA)及伴行的迷走神经、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，结扎CCA近心端，然后结扎ECA近心端，在距离CCA分叉处4 mm处的血管壁上做一个小切口，轻轻插入线身直径为0.26 mm，线头硅胶直径为(0.36±0.02)mm的线栓，使其头端到达大脑中动脉起始处(从MCA 至ECA 分叉处约2 cm)，以抵触感为度，将CCA远心端结扎，剪掉线栓以及其他的线，在创面上点几滴青霉素液预防感染。缝合切口。术后3 h、6 h各评分1次，做好记录。假手术组只是不插入栓线，其余步骤同手术组。缝合伤口，将术后大鼠置于电热毯保持体温。术后3 h采用Zea-Longa〔6〕5级4分法标准进行神经功能缺损程度评分，0分：无神经功能缺损症状;1分：轻微神经功能缺损，不能完全伸展右侧前爪;2分：中度局灶性神经功能缺损，向右侧转圈;3分：重度局灶性神经功能缺损，向右侧倾倒;4分：不能自发行走，意识水平下降。以分值≥1分作为造模成功的入组标准。造模插线操作超过15 min、术中出血多、麻醉过深呼吸不规律、术后3 h仍不能苏醒的动物不列入统计范围。

1.3.3大鼠一般情况监测模型动物体重、精神、活动情况、皮毛、尾色、大便等。

1.3.4神经功能Zea-Longa评分分别在术后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h进行神经功能Zea-Longa评分，评分由两位实验人员共同观察记录，每只大鼠仅做1次神经功能Zea-Longa评分，在单盲的条件下进行。

1.3.5放免法检测血浆CRH、血清ACTH、CORT含量实验末，大鼠经麻醉后由腹主动脉取血6 ml，其中3 ml加入已预先加入30 μl EDTA和40 μl抑的试管中，混匀，4℃，3 000 r/min，离心15 min，取上清置于-70℃冰箱保存备用。其余3 ml加入空白试管中，4℃，3 000 r/min，离心15 min，取上清置于-70℃冰箱保存备用。放免法检测血浆CRH、血清ACTH和CORT的含量，由北京康源瑞德生物科技有限公司严格按照试剂盒说明书要求进行检测。

1.4统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、最小显著差法(LSD)及非参数检验。

2　结　果

2.1大鼠一般状况一般大鼠在手术完成后1.5～2 h苏醒，手术完成3 h后开始进行评分，可见大鼠偏瘫症状明显，表现前肢力弱，后肢拖拽，行走呈顺钟向追尾状，甚则向一侧倾倒，此外还可观察到48 h、72 h手术组的大鼠在造模后24 h均出现左侧睑裂变小，左眼球肿胀并且伴有分泌物，活动减少，身体蜷缩，肢体发凉，体重明显下降，肛周污染，稀便，舌质紫暗等症状，各时点假手术组动物均未出现神经功能缺损症状。

2.2各组大鼠神经功能Zea-Longa评分变化与假手术组比较，各时间点手术组大鼠Zea-Longa神经功能评分均明显增高(P<0.01)。见表1。

2.3各组大鼠血浆CRH的变化与正常组比较，假手术组6 h及手术组6 h血浆CRH均增高，但无统计学差异(P>0.05)，假手术组48 h、72 h血浆CRH无明显变化(P>0.05)，手术组48 h、72 h血浆CRH明显降低(P<0.05或P<0.01)。与假手术组比较，手术组48 h、72 h血浆CRH明显降低(P<0.01)；与手术组6 h比较，手术组48 h、72 h血浆CRH明显降低(P<0.01)。见表2。

2.4各组大鼠血清ACTH的变化与正常组比较，假手术组6 h、48 h和72 h血清ACTH无明显变化(P>0.05)，手术组6 h血清ACTH增高，但无统计学差异(P>0.05)；手术组48 h、72 h血清ACTH明显降低，其中72 h组具有统计学差异(P<0.05)。与假手术组比较，手术组48 h、72 h血清ACTH降低，其中72 h组具有统计学差异(P<0.01)；与手术组6 h比较，手术组48 h、72 h血清ACTH明显降低，72 h组具有统计学差异(P<0.05)。见表3。

2.5各组大鼠血清CORT的变化与正常组比较，假手术组6 h、48 h、72 h血清CORT有所升高(P>0.05)，手术组6 h、48 h、72 h血清CORT明显升高，以48 h、72 h组具有统计学差异(P<0.01)。与假手术组比较，手术组48 h、72 h血清CORT升高(P<0.05或P<0.01)。与手术组6 h比较，手术组72 h血清CORT明显升高(P<0.01)。见表4。

表1　各组大鼠神经功能Zea-Longa评分变化

与假手术组比较：1)P<0.01

表2　各组大鼠血浆CRH变化

与正常组比较：1)P<0.05,2)P<0.01；与假手术组比较：3)P<0.05；与6 h组比较：4)P<0.01

表3　各组大鼠血清ACTH的变化

与正常组比较：1)P<0.05,与假手术组比较：2)P<0.05；与6 h组比较：3)P<0.01

表4　各组大鼠血清CORT的变化

与正常组比较:1)P<0.01;与假手术组比较:2)P<0.05,3)P<0.01;与6 h组比较:4)P<0.01

3　讨　论

MCAO 大鼠模型是国内外研究脑梗死经典模型，改进后的线栓法简便、易重复，降低了动物死亡率，提高了成功率，复制的可逆性局灶性脑缺血模型是研究脑缺血再灌注损伤较为理想的模型〔7〕。本研究结果显示 MCAO大鼠模型造模初期可见偏瘫症状明显，表现为右侧肢体废用或力弱，行走呈顺钟向追尾状，甚则向一侧倾倒，一侧睑裂变小，球肿胀并且伴有分泌物，神经功能Zea-Longa评分明显增高。HPA轴是神经内分泌系统的重要组成部分，通过不同途径和机制来调节多巴胺系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统、交感神经系统和免疫系统，形成了复杂的神经内分泌免疫网络。糖皮质激素(在人类主要为皮质醇，而大鼠主要为皮质酮)是HPA轴的终末激素，HPA轴受上级和下级激素的促进和反馈作用，形成了复杂的调节通路。随着年龄增长HPA轴激素水平发生改变，老年男性较中年男性血清ACTH、COR明显增高〔8〕。老年(衰老)大鼠血清ACTH、CORT明显增高〔9〕。在许多情况下，HPA轴激活是机体的适应性反应，但是，过度长期的激活则对机体造成损害，压力、HPA轴激活与脑卒中关系密切。糖皮质激素在脑卒中结局中起决定性的作用，在脑卒中患者和缺血性脊椎动物模型上均可见到缺血周边区糖皮质激素浓度增高与较差的脑卒中结局有关〔1〕。短暂性脑缺血发作引起的急性脑缺血启动了中枢神经系统和HPA轴一系列复杂的事件，最终导致神经元和细胞的损伤。HPA轴激活持续时间和规模受CRH的增加，抗利尿激素和糖皮质激素，包括皮质醇等激素的调控。研究表明，在中风后激活这些激素可导致神经激素的功能障碍，会加剧长期预后，HPA轴的变化在脑缺血中起着重要的作用〔2〕。HPA轴激活是脑卒中早期的普遍现象，皮质醇增多症是其突出表现，细胞因子可能影响HPA轴。脑梗死患者白细胞介素(IL)-6与COR相关，在脑卒中早期存在HPA轴调节异常〔3〕。大脑左侧半球与右侧半球卒中影响HPA轴的反应不同，左侧半球卒中患者晨起COR水平明显增高〔10〕。HPA轴功能紊乱是脑血管病、2型糖尿病及脑卒中的又一危险因素〔4〕。急性脑血管病患者COR、ACTH均高于健康对照组，血清ACTH、COR 含量与脑损伤范围呈正比〔5〕。

本研究结果显示模型大鼠在缺血6 h时，血浆CRH、血清ACTH、CORT增高，随着缺血时间的延长，血浆CRH、血清ACTH下降，而血清CORT进一步增高，表明MCAO模型大鼠存在明显的HPA轴功能紊乱。以HPA轴为切入点，调节紊乱的HPA轴功能可能为脑血管疾病的防治提供新的途径。

1Stuller KA,Jarrett B,DeVries AC.Stress and social isolation increase vulnerability to stroke 〔J〕.Exp Neurol,2012;233(1):33-9.

2Radak D,Resanovic I,Isenovic ER.Changes in hypothalamus-pituitary-adrenal axis following transient ischemic attack〔J〕.Angiology,2014;65(8):723-32.

3Johansson A,Olsson T,Carlberg B,etal.Hypercortisolism after stroke partly cytokine mediated〔J〕?J Neurol Sci,1997;147(1):43-7.

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5刘波,张红宇,牛建平,等.急性脑血管病下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴变化的观察〔J〕.卒中与神经疾病,2002;9(6):362-3.

6Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats 〔J〕.Stroke,1989;21(20):84-91.

7吴松笛,耿晓英.改良线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的实验研究〔J〕.陕西医学杂志,2006;35(10):1316-8.

8林英,王卫东,叶山东,等.中老年男性下丘脑-垂体-肾上腺轴激素水平改变与生活质量关系的研究〔J〕.中国临床保健杂志,2013;16(2):136-8.

9姚建平,金国琴,戴薇薇,等.右归丸对衰老大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴功能变化的影响〔J〕.中药药理与临床,2010;26(1):8-10.

10Lueken U,Leisse M,Mattes K,etal.Altered tonic and phasic cortisol secretion following unilateral stroke〔J〕.Psychoneuroendocrinology,2009;34(3):402-12.

〔2014-12-03修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.026

北京中医药大学校级课题资金资助(2011-JDJS-04)；北京中医药大学创新团队项目(2011-CXTD-22)

高颖(1963-)，女，主任医师，教授，医学博士，博士生导师，博士后指导教授，主要从事神经系统疾病的中医药防治研究。

吴相春(1973-)，男，副主任医师，医学博士，在站博士后，主要从事神经系统疾病的中医药防治研究。

R331

A

1005-9202(2016)14-3411-03；