慢性应激和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对大鼠空间学习和记忆能力的影响及其作用机制

魏艳霞

(南阳市中心医院，河南　南阳　473003)



慢性应激和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对大鼠空间学习和记忆能力的影响及其作用机制

魏艳霞

(南阳市中心医院，河南南阳473003)

目的观察慢性应激和组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对大鼠空间学习和记忆能力的影响及其作用机制。方法将58只雄性SD大鼠随机地分为对照+生理盐水组、对照+丁酸钠组、慢性应激+生理盐水组及慢性应激+丁酸钠组。慢性应激组给予连续21 d制动应激，应激结束后将每组大鼠随机选出8只采用Y迷宫及Morris水迷宫检测空间学习、记忆能力，余下大鼠采用 蛋白质免疫印迹(WB)检测海马组蛋白H3、H4乙酰化和反应元件结合蛋白(p-CREB)、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达变化。结果慢性制动应激的大鼠较未应激大鼠体重增长缓慢(P<0.01)。在Y迷宫测试中，各组大鼠进入各个臂次数百分比差异无统计学(P>0.05)；各组大鼠在三个臂的停留时间百分比的分析，组间比较无统计学差异(P>0.05)，而组内分析发现，对照+生理盐水组、对照+丁酸钠组和慢性应激+丁酸钠组在新异臂的停留时间远多于其他两臂(P<0.05)；此外，单因素方差分析显示慢性应激+生理盐水组在各个臂的总穿越次数较对照+生理盐水组多明显减少(P<0.05)。水迷宫定位导航试验实验显示，各组大鼠平均潜伏期组内、组间均差异显著；定位导航试验第2天，对照+丁酸钠组平均潜伏期较对照+生理盐水组有明显增高(P<0.05)；而慢性应激+生理盐水组大鼠在训练第3天的平均潜伏期显著高于对照+生理盐水组，同时慢性应激+丁酸钠组找寻找平台的时间也明显低于慢性应激+生理盐水组(P<0.05)。水迷宫空间探索试验中，大鼠在目标象限游泳时间、距离百分比及穿越平台区域的次数均无显著差异(P>0.05)；而对大鼠在目标象限及目标相反象限的游泳时间进行统计发现，组内有显著差异(P<0.01)，而组间差异不明显(P>0.05)；慢性应激+生理盐水组大鼠在两个区域的游泳时间无明显差异，而其余三组大鼠在目标象限的游泳时间均显著高于其在目标相反象限的时间(P<0.01)。WB结果提示慢性应激+生理盐水组大鼠acH3蛋白含量的低于对照+生理盐水组(P<0.05)，而acH4蛋白含量虽有降低趋势，却无统计学差异；慢性应激+丁酸钠组与慢性应激+生理盐水组大鼠相比较，acH3、acH4蛋白水平均明显增加(P<0.01)。慢性应激+生理盐水组大鼠海马p-CREB水平明显低于对照+生理盐水组(P<0.01)，其BDNF含量也同样低于对照+生理盐水组(P<0.05)；慢性应激+丁酸钠组与慢性应激+生理盐水组大鼠相比p-CREB、BDNF含量均有明显增加(P<0.01、P<0.05)；对照+丁酸钠组组大鼠相对于对照+生理盐水组BDNF含量有所减少(P<0.05)，而p-CREB含量则无明显变化。结论慢性应激可减缓大鼠体重增长，损害其空间学习和记忆水平，而丁酸钠可以对应激大鼠的学习记忆起保护作用，其可能是通过影响海马组蛋白乙酰化及认知相关蛋白表达而实现。

慢性应激；丁酸钠；空间学习记忆

多种神经递质及认知相关蛋白表达的改变参与了慢性应激所致认知损害进程〔1～3〕。丁酸钠作用于离体的大鼠脑片时可显著增加慢性不可预知应激模型大鼠海马区域的组蛋白乙酰化水平，尤其是H4 的乙酰化水平较给予丁酸钠的正常大鼠的脑片有显著增加〔4〕。慢性应激可能通过增强HDAC 的作用，引起大鼠海马组蛋白乙酰化水平下降，减低认知相关蛋白的转录，导致神经突触结构和功能受损，出现认知功能损害〔5〕，因此，上调大鼠海马组蛋白乙酰化水平对慢性应激大鼠认知功能损害的作用值得期待。本研究拟观察其对大鼠海马组蛋白乙酰化水平及认知相关分子表达的变化。

1　材料和方法

1.1材料实验动物：本实验选用雄性SPF 级Spraque-Dawley 大鼠56 只，体重(200±20)g，由四川大学动物实验中心提供，动物合格证号SCXK(JII19)。大鼠饲养于SPF环境，每笼4 只，室温(22±2)℃，湿度50%～55%，昼夜节律12 h/12 h。大鼠可自由饮食饮水，在适应环境1 w后开始实验，每周称重一次。

主要仪器和试剂：2K15高速冷冻离心机，Sigma公司；752-P紫外分光光度计，上海现科仪器有限公司；PL-203电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂；DYCZ-24D垂直电泳槽，北京六一仪器厂；DYCZ-40D电转印系统，北京六一仪器厂；WD-9405A脱色摇床，北京六一仪器厂；79-1磁力搅拌器，常州澳华仪器有限公司；BCD-186 冰箱，西门子；ECL Plus显色试剂盒，安玛西亚公司；PVDF 膜，Millipore 公司；聚丙烯酰胺，Sigma 公司；SDS，Sigma公司；Tris-base，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，Roche公司；蛋白marker(10～170 kD)，Fermentas 公司；β-actin，Santa 公司；Anti-acetyl Histone H4(Lys5/8/12/16)，Millipore 公司；Anti-acetyl Histone H3(Lys14)，Millipore 公司；Anti-phospho-CREB，Millipore 公司；Anti-BDNF，Millipore 公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1实验分组随机分为对照生理盐水组、对照丁酸钠组、应激生理盐水组及应激丁酸钠组，每组各14只，各组平均体重差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2.2给药方案慢性应激组大鼠均给予21 d连续制动应激，对照组均饲养于标准环境，大鼠统一在实施应激前半小时给8.4 ml/100 g 生理盐水或丁酸钠溶液腹腔注射。腹腔注射前用碘酒消毒注射区域皮肤，每天更换注射器。本实验生理盐水均采用医疗注射用生理盐水，丁酸钠购于美国Sigma公司，避光保存，每日注射前新鲜配制，用生理盐水配制成浓度为10%的溶液，摇匀后使用。

1.2.3慢性制动应激模型慢性应激装置参照文献〔6〕自制。由薄铁皮制成无盖盒子，上有可自由开合的金属网盖，盒内平均分隔为四个长方形格子(20 cm×7.5 cm×8 cm)，每格可放一只大鼠。放入大鼠后可根据动物的大小加入合适的长条形木板，以更好的限制大鼠的活动。应激组大鼠在标准环境中采用该装置给予连续21 d每天6 h(10：30～16：30)的慢性制动应激。应激结束后彻底冲洗应激装置，晾干备用。

1.2.4Y迷宫测试关闭新异臂入口处的活动门，将动物由起始臂起始端放入迷宫，任其自由探索起始臂及臂15 min；结束4 h之后，打开活动门，将动物由起始臂放入迷宫，任其自由探索三个臂5 min。实验在同样的光线下进行，避免昼夜节律对动物活动度的影响。在每次实验后采用酒精擦洗实验装置以避免气味对动物的影响。动物放入迷宫后，测试者迅速离开，避免人为干扰。整个实验过程由迷宫正上方的摄像头记录，由专业软件分析。

1.2.5Morris水迷宫测试每天将大鼠由4 个入水点分别放入水中一次，入水点的先后顺序随机产生。记录找到平台的时间，即逃避潜伏期作为大鼠学习水平的依据。大鼠每次寻找平台的时间设定为60 s，时间结束后用木棍引导尚未找到平台的大鼠到达平台，未找到平台的大鼠的潜伏期记录为60 s。所有大鼠上平台后停留20 s，使其通过观察周围环境记住平台的位置，学习结束后放回笼中。本实验中定位导航试验共进行5 d，所有训练在每天同一时间完成，在第7天进行空间探索试验：撤掉水中的平台，选择SW 作为入水点，记录大鼠在30 s内的游泳轨迹，软件可测算大鼠在四个象限游泳的速度、距离、时间等，也可记录大鼠在之前平台区域的穿越次数，以上数据均可表示大鼠对原来水下平台的记忆能力。

1.2.6WB检测在应激结束后间隔一天，即实验第23 d进行组织取材。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(350 mg/kg)，大鼠对疼痛刺激无反应后迅速断头，用小止血钳小心剥离颅骨，取出脑组织置于冰上，快速分离出大鼠双侧海马组织，分别置于标记好的冻存管后立即放入液氮中暂存，待所有组织取完后统一放入-80℃冰箱中保存，随后进行WB检测。取100 mg/ml BSA，室温融化后用生理盐水稀释至1 mg/ml；取离心管，分别加入相应试剂，混匀后，室温放置2 min，用分光光度计比色分析，制作标准曲线；将1 μl待测蛋白加入900 μl Bradford和99 μl生理盐水，混匀后在595 nm处检测吸光度。根据标准曲线计算出样本的蛋白浓度。

1.2.7SDS-PAGE电泳将两块清洁玻璃板对齐后放入夹中卡紧；加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶充分凝固后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；配5%的浓缩胶，加入TEMED后充分混合，将剩余空间灌满，然后将梳子插入浓缩胶中，待胶凝固后垂直将梳子拔出。用去离子水冲洗后将加样孔中液体用滤纸吸去；根据所测蛋白含量，计算含40 μg蛋白的溶液体积即为上样量。取蛋白标本至离心管中，加入适量蛋白上样缓冲液。上样前沸水浴5 min使蛋白变性；加入足量电泳液后开始电泳。浓缩胶电压为75 V；分离胶电压为120 V，当溴酚蓝前沿电泳到分离胶底部时终止电泳，进行转膜。

1.2.8免疫反应将转好的PVDF膜置于室温下脱色摇床上的封闭液中，封闭1 h；用TBST 溶解的5%脱脂牛奶将一抗稀释1 000倍，将PVDF膜蛋白朝下放于抗体液面，赶出气泡，4℃过夜。用TBST在室温下脱色，并在摇床上洗3次，每次5 min；将二抗用TBST稀释3 000倍，室温下孵育30 min后，用TBST在室温脱色摇床上洗3次，每次5 min。

1.3统计学分析采用GraphPad Prism 5.0 软件行Two-way ANOVA、Bonferroni post-test和One-way ANOVA检验。

2　结　果

2.1体重变化各组大鼠在实验过程中体重均平稳增长，应激前各组体重无明显差异(P>0.05)，而从应激开始后体重差异逐渐出现。接受慢性制动应激的大鼠(应激生理盐水组、应激丁酸钠组)较未应激大鼠(对照生理盐水组、对照丁酸钠组)体重增长缓慢。与对照生理盐水组相比，应激丁酸钠组在第8天、第21天体重有明显降低(P<0.01)；而应激生理盐水组在第8、15、21天与对照生理盐水组相比体重明显降低(P<0.01)。对照生理盐水组大鼠与对照丁酸钠组相比体重略有减低，但无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2Y迷宫试验结果在应激结束后1 d，各组大鼠中分别随机选出8只进行行为学测试，每组剩余6只取材用于生化指标检测。各组大鼠进入新异臂的次数及停留时间百分比均无统计学差异(P>0.05)。各组大鼠进入各个臂次数百分比组间无显著差异，而组内分析发现四组大鼠进入新异臂的次数均显著高于其他两臂(P<0.01)。而对于各组大鼠在三个臂的停留时间百分比的分析，组间分析无统计学差异(P>0.05)，组内分析发现，对照生理盐水组、对照丁酸钠组及应激丁酸钠组在新异臂的停留时间远多于其他两臂(P<0.01)，而应激生理盐水组在三个臂的停留时间无统计学差异(P>0.05)。单因素方差分析显示应激生理盐水组〔(12.25±2.31)次〕在各个臂的总穿越次数较对照生理盐水组〔(20.04±4.16)次〕多明显减少(P<0.05)，应激丁酸钠组〔(14.36±1.87)次〕总穿越次数相对对照生理盐水组和对照丁酸钠组〔(18.41±2.79)次〕有所减少，但差异无统计学意义。见表2、表3。

表1　大鼠体重变化(g,n=14)

与对照生理盐水组比较：1)P<0.01

表2　Y迷宫试验停留时间结果

表3　Y迷宫试验停留时间、次数百分比结果

与其他两臂比较：1)P<0.05

2.3Morris 水迷宫试验结果Two-way ANOVA 显示各组大鼠平均潜伏期组内(F3，140=2.98)、组间(F4，140=88.45)均有统计学意义(P<0.05)。Bonferroni posttest 显示定位导航试验第2天，对照丁酸钠平均潜伏期较对照生理盐水组有明显增高(P<0.05)；而应激生理盐水组大鼠在训练第3天的平均潜伏期显著高于对照生理盐水组(P<0.01)。见表4。One-way ANOVA 显示，大鼠在目标象限游泳时间百分比及穿越平台区域的次数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表5。

采用Two-wayANOVA 对各组大鼠在目标象限及目标相反象限的游泳时间进行统计，组内(F1，56=47.5，P<0.01)，而组间差异则不具有统计学意义(F3，56=0.39，P>0.05)。应激生理盐水组大鼠在两个区域的游泳时间无明显差异，而其余三组大鼠在目标象限的游泳时间均显著高于其在目标相反象限的时间(P<0.01)。见表6。

2.4海马acH3 和acH4 蛋白含量应激生理盐水组大鼠acH3 蛋白含量的低于对照生理盐水组(t=2.73，P<0.05)，而acH4 蛋白含量虽有降低趋势但却无统计学意义；应激丁酸钠组与应激生理盐水组大鼠相比较，acH3、acH4 蛋白水平均明显增加(P<0.01)；对照丁酸钠组大鼠则与对照组蛋白表达水平无明显差异。见表7。

表4　Morris 水迷宫试验潜伏期结果

与对照生理盐水组比较：1)P<0.05,2)P<0.01

表5　Morris 水迷宫试验平台穿越结果

表6　Morris 水迷宫游泳时间结果

与同组目标相比较：1)P<0.01

表7　大鼠海马acH3 和acH4 蛋白含量

与对照生理盐水组比较：1)P<0.05；与对照丁酸钠组比较：2)P<0.01

2.5海马p-CREB、BDNF 含量应激生理盐水组大鼠海马p-CREB 水平明显低于对照生理盐水组(P<0.01)，其BDNF 含量也低于对照生理盐水组(P<0.05)；应激丁酸钠组与应激生理盐水组大鼠相比较p-CREB、BDNF 含量均有明显增加(P<0.01、P<0.05)；对照丁酸钠组大鼠相对于对照生理盐水组BDNF 含量有所减少(P<0.05)，而p-CREB 含量则无明显变化。见表8。

表8　大鼠海马p-CREB、BDNF 含量

与对照生理盐水组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与对照丁酸钠组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

3　讨　论

本研究采用两种迷宫来检测各组大鼠的学习和记忆水平，结果显示慢性应激能够在一定程度上损害大鼠的空间识别记忆及空间参考记忆。慢性应激可对大鼠的空间识别记忆造成损伤，这与之前的研究结果一致〔7～10〕。此外，应激强度的改变对空间识别能力亦有影响，在Y 迷宫试验中，本文说明应激后大鼠的活动性降低，跟造模过程中对应激大鼠的观察一致。而对体重的分析同样发现应激造成了大鼠的抑郁样行为，与众多的实验结果相一致〔11〕。在水迷宫定位导航试验中发现慢性应激在一定程度上损伤了大鼠的空间参考记忆。丁酸钠属于非选择性HDAC抑制剂，可以抑制I 和IIa 型HDAC。本文的研究发现，丁酸钠可对大鼠空间记忆的损害起保护作用。同样丁酸钠对于大鼠的应激后的抑郁样行为也有轻微改善。正常大鼠腹腔给予丁酸钠则不会对认知造成影响或造成认知功能的损害。免疫沉淀法研究发现，影响多种基因转录的启动子附近组蛋白乙酰化的部位在H3、H4，所以本文常检测acH3、acH4 的表达来表示组织乙酰化的水平〔7〕。本研究应激对照说明慢性应激可降低大鼠海马乙酰化水平，尤其是acH3的乙酰化水平，而丁酸钠可以逆转应激大鼠这种乙酰化的降低，尤其是对于H4 的作用更为明显；但丁酸钠对正常大鼠海马中两种组蛋白的乙酰化水平无显著作用。最近一项关于HDAC 抑制的研究显示〔11〕，丁酸钠作用于离体的大鼠脑片，可显著增加慢性不可预知应激模型大鼠海马区域的组蛋白乙酰化水平，尤其是H4 的乙酰化较给予丁酸钠的正常大鼠的脑片有显著增加，这与本文的研究结果向一致。对另一种III 型HDAC 抑制剂sirtinol 的研究发现〔12〕，sirtinol 对应激后的大鼠脑片作用明显，可显著增加应激大鼠海马CA3 及DG 组蛋白乙酰化水平，而对于正常大鼠，其对海马区域乙酰化水平的增加几乎没有作用，甚至轻度降低了H3 的磷酸化水平，再次证明丁酸钠对病理状态的大鼠与对正常大鼠的作用效果不同。

本研究说明慢性束缚应激显著降低了海马p-CREB 的含量，可能通过其对BDNF基因表达的调控，降低应激大鼠海马中该因子的含量，而丁酸钠能够逆转这种蛋白的降低。结合组蛋白乙酰化的结果推测，丁酸钠可能是通过调整海马的乙酰化话水平，增加相应区域p-CREB 的含量，进而影响BDNF 的表达；而丁酸钠对正常大鼠BDNF的表达有不利影响，这与本文行为学中丁酸钠降低正常大鼠的认知功能的结果相一致，说明丁酸钠对认知功能的作用与海马中BDNF 的含量密切相关，再次证实BDNF 在动物认知功能中的重要作用，与既往的研究结果相吻合〔13〕。综上研究结果可推测，组蛋白去乙酰化酶丁酸钠对慢性制动应激大鼠的认知功能具有保护作用，其机制可能是通过恢复慢性激大鼠海马区域的组蛋白乙酰化水平，进而上调认知相关蛋白如p-CREB、BDNF 的表达来实现，其详细机制需进一步实验研究。本文阐明丁酸钠对慢性应激大鼠认知功能的作用机制，有望对预防及治疗慢性应激所致认知损害提供新的理论依据及治疗方法。

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〔2016-01-18修回〕

(编辑滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.018

魏艳霞(1975-)，女，硕士，主要从事骨科与神经科康复研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3391-04；