核桃青皮不同溶剂提取物的体外抗氧化活性

何念武，白瑶，陈明山

（1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛　726000；2.陕西省烟草公司商洛市公司，陕西商洛　726000）

核桃青皮不同溶剂提取物的体外抗氧化活性

何念武1，白瑶1，陈明山2

（1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000；2.陕西省烟草公司商洛市公司，陕西商洛726000）

为了深入研究商洛核桃青皮不同溶剂提取物的体外抗氧化活性。在DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子以及总还原力等体外抗氧化体系上测定不同溶剂提取物的体外抗氧化活性。研究结果表明，核桃青皮不同溶剂提取物均有一定的体外抗氧化活性，且抗氧化能力呈现出良好的量效关系，其中水提物、95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物的抗氧化活性高于乙醚与氯仿提取物。总体而言，核桃青皮乙酸乙酯提取物和乙醇提取物体外抗氧化活性最好。

核桃青皮；不同溶剂提取物；自由基；抗氧化活性

核桃青皮，中药材名为青龙衣（Cortex Juglans Mandshuricae），为胡桃科（Juglandaceae）植物胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim）未成熟的外果皮，气微，味微苦，有毒，主产于东北、河北、山东、山西、陕西等地。始载于《开宝本草》，称为胡桃青龙，《救急方》中称为青胡桃皮，自《山东中草药手册》称为“青龙衣”后，现多延用此名称［1］。研究表明，胡桃中主要含有黄酮类、醌类、鞣质、没食子酸类化合物等活性成份，并且核桃青皮中也含有这些活性物质［2-3］。研究发现，核桃青皮具有抗肿瘤［4］、抑菌［5］、抗炎镇痛［6］等功效。此外，在民间有用青核桃泡酒来治疗神经性皮炎的报道［7］。临床上，李淑芳等［8］使用青龙衣酊剂可有效治疗白癜风。吴学勤等［9］将晒干的青龙衣水煎剂用来治疗Ⅱ型糖尿病。吕俊芳等［10］从青龙衣中提取天然色素，而许泽宏等［11］进一步研究确定这种色素可以作为天然食用色素，在食品工业中有很好的应用价值。然而，对于久负盛名的商洛核桃的相关研究则很少，尤其是关于核桃青皮的研究更是鲜有报道。商洛作为全国核桃主产区之一，每年都有大量的核桃青皮被倒入田间地头、河流，严重污染环境。如果能够从商洛核桃青皮中提取具有一定价值的活性成分，就有可能将其开发成天然抗氧化剂，这对于保护生态环境和以核桃青皮为原材料的新产品研发都具有重要意义。

1　材料与方法

1.1实验材料与试剂

核桃青皮，于2014年8月采自商洛洛南县寺坡中山，自然晾干。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮双 （3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、还原型辅酶（NADH）、吩嗪甲硫酸盐（PMS）、BHT（二丁基羟基甲苯）均购于sigma公司，氮蓝四唑（NBT）上海蓝季科技发展有限公司，其余试剂均为化学分析纯，实验过程用水均为蒸馏水。

1.2实验方法

1.2.1核桃青皮提取物的制备

用不同溶剂提取核桃青皮所得提取物。将核桃青皮粉碎，过60目筛，备用。取核桃青皮粉末70 g，用纱布包好，放入索氏提取器中，按料液比1：10加入提取溶剂，浸泡20 min，超声（40 kHz，25℃）提取3次，每次45 min。减压浓缩，放入40℃烘箱中干燥，研磨成细粉，即得不同溶剂提取物，置干燥的试剂瓶中或放入冰箱备用。

1.2.2DPPH法

参照何念武等［12-13］方法并稍加调整，将试验中DPPH溶液的溶剂甲醇改为乙醇，同时浓度调整为0.005%，静置时间改为15 min。取不同质量浓度的样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg·mL-1）各1 mL分别于1、2、3、4、5、6、7号离心管中，此后试剂添加次序不变，于517 nm处测吸光度（Ai），以溶剂代替样品液作阴性对照（Aj），以相同浓度梯度的BHT作为阳性对照。

清除率/%=（1-Ai/Aj）×100

1.2.3ABTS法

参照何念武等［13］方法并做适当修改，将ABTS溶液浓度调整为5 mmol·L-1，K2S2O4水溶液浓度调整为50 mmol·L-1，二者等体积混合均匀，避光放置备用（宜现配现用），即得到（ABTS+）溶液，用磷酸盐（PBS）缓冲溶液将ABTS+溶液稀释至在734 nm波长处吸光度为0.70±0.02。取不同浓度的样品溶液各1 mL，分别放于1、2、3、4、5、6、7号试管中，加入2.0 mL ABTS+溶液，混合均匀，分别在1、3、5、10 min时测其吸光度。ABTS+自由基清除率（S%）计算公式如下：

S%=（A0-A）/A0，其中A0为ABTS+溶液的吸光度，A为加药液后的吸光度。

1.2.4总还原力测定方法

参照何念武等［12］方法进行。

1.2.5羟自由基清除能力测定方法

利用Fenton体系法测定并稍作改进，将试验中过氧化氢用量调整为0.5 mL，水杨酸浓度和用量分别调整为0.035 mol·L-1和1 mL。取不同质量浓度的样品溶液及相同浓度梯度的BHT溶液各1 mL，先后加入1.5 mL反应液（含0.05 mmol·L-1EDTA、0.05 mmol·L-1FeCl3、1.4 mmol·L-1的PBS缓冲液）和20 mL H2O2，静置10 min后加入水杨酸，37℃水浴45 min，终止反应，于510 nm处测其吸光度（Ai），样品溶剂为阴性对照（Aj），BHT为阳性对照。

清除率/%=（1-Ai/Aj）×100

1.2.6超氧阴离子清除能力测定法

根据何念武等［12-13］方法并加以改进，将NBT浓度改为0.05 mol·L-1，NADH浓度改为0.45 mol·L-1，PMS浓度改为 0.024 mol·L-1，用量均为1 mL，三种试剂添加次序不变。取上述不同质量浓度的样品溶液及BHT溶液各1 mL，分别放于1、2、3、4、5、6、7号试管中，依次加入NBT、NADH、PMS溶液，混匀，室温放置5 min，测其560 nm吸光度（Ai），用溶剂作阴性对照（Aj），以相同浓度梯度的BHT作阳性对照。

清除率/%=（1-Ai/Aj）×100

2　结果与分析

2.1不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除作用

由图1可以看出，核桃青皮几种不同溶剂提取物对DPPH自由基都具有一定的清除作用，且清除率随着样品浓度的增加而增大，在整个递增过程中95%乙醇提取物的清除率与阳性对照组（BHT）非常接近。当浓度为3.5 mg·mL-1时，BHT的清除率是95.36%，95%乙醇提取物的清除率为89.95%，两者无明显差异。由于BHT是公认的抗氧化剂，说明商洛核桃青皮提取物具有较强的体外抗氧化能力。

图1　不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力

2.2不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除作用

ABTS经活性氧活化后生成稳定的淡蓝绿色阳离子ABTS自由基，当其遇到抗氧化物质时会与其发生颜色反应，然后在ABTS自由基的最大收波长（一般为734 nm）下检测吸光度变化情况，继而反映该物质的抗氧化能力强弱。因此，从图2中可以看出，同一时间段核桃青皮不同溶剂提取物对ABTS自由基都具有一定的清除作用，且随样品浓度的增加而增大。当浓度达到3.5 mg·mL－1时，95%乙醇提取物的清除率与BHT基本相当，无明显差异。几种提取物清除ABTS自由基的能力大小依次为：95%乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物＞氯仿提取物＞乙醚提取物。

图2　不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除能力

2.3不同溶剂提取物的总还原力

通过对样品总还原力的测定，可以判断其是否是良好的电子供体，其供应的电子除了可使Fe3+还原为Fe2+外，还可以参与自由基的反应，从而使其形成稳定的物质便于后期分析检测。

从图3可知，核桃青皮不同溶剂提取物和BHT的总还原力都随着样品浓度的增加而增加，随着样品浓度的递增乙酸乙酯、95%乙醇提取物和BHT的吸光度非常接近，无明显差异。几种提取物的总还原力大小依次为：乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物＞乙醚提取物。

2.4不同溶剂提取物对羟自由基的清除能力

从图4中可以看出，核桃青皮不同溶剂提取物可有效清除羟基自由基，当样品浓度达到3.5 mg·mL-1时乙酸乙酯提取物的清除率为88.67%，而此浓度下BHT的清除率为90.68%，二者的清除率无明显差异，表明核桃青皮提取物具有很好的羟自由基清除能力。而羟基自由基（·OH）是ROS家族中非常活跃的一类自由基，其能迅速与它接触的物质发生氧化反应，从而导致衰老、慢性疾病的发生。

图3　不同溶剂提取物的总还原力

图4　不同溶剂提取物对对羟自由基清除能力

2.5不同溶剂提取物对超氧阴离子的清除能力

从图5中可以看出，核桃青皮不同溶剂提取物对超氧阴离子均有清除能力，其清除能力随着样品浓度的增大而增强。当样品浓度为3.5 mg·mL－1时，可以看出BHT、乙酸乙酯提取物的清除率无明显差异。五种不同溶剂提取物对超氧阴离子的清除能力为：乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞水提取物＞氯仿提取物＞乙醚提取物。众所周知，超氧阴离子对生物体的DNA有损伤作用，它不仅能产生不同形态的氧化因子，继而进行脂质过氧化，而且能同时放大细胞损伤，严重危害人体健康。因此，研究清除超氧阴离子具有重要意义。

图5　不同溶剂提取物对超氧阴离子的清除能力

2.6各自由基体系的半数抑制浓度（IC50）

IC50值，即半数抑制率，也可称作半数抑制浓度或者半数有效剂量等。常用来衡量活性物质或某种药物对抗刺激剂或者诱导剂所致反应的强弱，其活性越强，则IC50值越小。本实验的IC50值是通过样品浓度与计算出的抑制率，在IC50计算软件中算出IC50值。结果如表2。

表2　各自由基体系的IC50值

3　结论与讨论

通过DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基、超氧阴离子以及总还原力等评价体系较详尽地对商洛核桃青皮不同溶剂提取物体外抗氧化活性进行试验，研究结果表明，核桃青皮具有较好的体外抗氧化能力，其抗氧化能力随着样品浓度的增大而增强，并且呈现出良好的剂量效应关系。当样品浓度逐渐增大，其清除率愈接近阳性对照。总体而言，乙酸乙酯提取物和95%乙醇提取物的活性是最好的，这可能是与其有效成分有关，有待进一步研究。此外，翟梅枝［3］和蒋丽萍［4］等研究也表明核桃青皮主要的活性成分都是易溶于乙醇或者乙酸乙酯的，这与本研究结论一致。

众所周知，天然产物活性成分主要是多酚类、黄酮类、醌类以及多糖等［14］，而在这些活性成分里面已知抗氧化活性较强的无非就是多酚类与黄酮类，其次才是多糖和醌类等其他成分，这与贾东升等［15］的研究结论一致。据此可以推测核桃青皮提取物具有开发成天然抗氧化剂的潜能，同时对于保护生态环境和新药研发都具有重要意义。

［1］南京中医药大学.中药大辞典（上册）［M］.上海：上海科学技术出版社，2006：1744-1745.

［2］沈广志，邹桂华，梁婷，等.核桃楸的化学成分研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（17）：219-224.

［3］翟梅枝，晏婷，王元，等.胡桃属植物青皮和叶的化学成分及其生物活性研究进展［J］.西北植物学报，2011，31 （10）：2133-2138.

［4］蒋丽萍，刘宝瑞，胡文静.青龙衣的化学成分及其抗肿瘤作用的研究进展［J］.现代肿瘤医学，2014，22（11）：2735-2737.

［5］任先伟，魏晓璐，黄鑫，等.核桃青皮提取物抑菌活性及抑菌机理研究［J］.食品工业科技，2015，36（18）：93-98.

［6］宛蕾，陈秀芬，杜江.胡桃青皮抗炎及镇痛作用的研究［J］.中国药理与临床，1999，15（2）：29-30.

［7］付淑芳.青核桃皮酒外搽治神经性皮炎［J］.老同志之友，2006（2）：53-54.

［8］李淑芳，孙光春，鲍淑娟，等.核桃皮酊剂毒性试验研究［J］.贵阳医学院学报，1997，22（4）：356-358.

［9］吴学勤，张继兴.青龙黄芪汤治疗Ⅱ型糖尿病的体会［J］.中华医药学报，1996，11（4）：60-61.

［10］吕俊芳，张美丽，刘启瑞，等.核桃外果皮中棕褐色色素的提取及性质测试［J］.化学研究与应用，2001，13（4）：387-389.

［11］许泽宏，谭建红，张霞，等.核桃外皮天然食用色素的提取与理化性质［J］.四川师范大学学报（自然科学版），2006，29（4）：488-490.

［12］何念武，杨兴斌，田灵敏，等.黄瓜多糖的体外抗氧化活性［J］.食品科学，2011，32（19）：70-74.

［13］何念武，李丹.商洛绿茶多糖的分离纯化及体外抗氧化和抗肿瘤活性［J］.食品与发酵工业，2015，41（8）：79-83.

［14］李成舰，彭裕红.天然药物化学［M］.化学工业出版社，2013：15-17.

［15］贾东升，李荣乔，谢晓亮，等.连翘叶不同溶剂提取物体外抗氧化活性研究［J］.食品研究与开发，2016，37（2）：14-18.

（责任编辑：李堆淑）

A Study on Antioxidant Activity of Different Solvent Extracts of Walnut Green Husk

HE Nian-wu1，BAI Yao1，CHEN Ming-shan2
（1.CollegeofBiopharmaceuticalandFoodEngineering，ShangluoUniversity，Shangluo726000，Shaanxi；Shangluo Municipal Tobacco Company of Shaanxi Province，Shangluo726000，Shaanxi）

In order to study the in vitro antioxidant activity of the different solvents extract from walnutgreenhuskinShangluo.Invitroantioxidantactivityofdifferentsolventsextractswas determinedonDPPHradical，ABTSradical，hydroxylfreeradical，superoxideanionandtotal reducing power.The results showed that the walnut green husk of different solvent extracts had certain antioxidant activity in vitro，and the antioxidant ability was showing a good dose effect relationship，wherein the aqueous extract，ethanol extract，antioxidant activity of the ethyl acetate extract is higher than that of ether and chloroform extracts.Overall，the best green activity of ethyl acetate extract and ethanol extracts of walnut antioxidant.

walnut green husk；different solvent extract；free radical；antioxidant activity

TS201.2

A

1674-0033（2016）04-0044-05

10.13440/j.slxy.1674-0033.2016.04.012

2016-04-24

陕西省教育厅专项科研计划项目（15JK1219）；商洛市烟草公司科技项目（KJ-2014-02）

何念武，男，陕西洛南人，硕士，讲师