铁离子引起的DNA电荷逆转和凝聚

郭子龙,王艳伟,杨光参

(温州大学物理与电子信息工程学院，浙江 温州 325035)



铁离子引起的DNA电荷逆转和凝聚

郭子龙,王艳伟*,杨光参*

(温州大学物理与电子信息工程学院，浙江 温州 325035)

摘要：在生物体中，DNA会凝聚成紧密结构，对于遗传信息的储存和转录有重要意义。对于DNA的凝聚以及伴随的电荷逆转已经有了比较深入的研究，这些研究大多集中于一些水解性较弱的离子，而对于那些易水解对于溶液pH影响较大的金属离子(例如铁离子)的研究较少。本文系统地研究了铁离子引起的DNA电荷逆转和凝聚，通过与DNA在三氯六氨络合钴凝聚的对比，探索了铁离子引起的DNA的电荷逆转和凝聚的可能机制。

关键词：铁离子；DNA；电荷逆转；凝聚

DNA作为一种重要的生物大分子，在体液环境中带有较高的负电荷，并且被溶液中的带有正电的平衡离子所包围着。在DNA参与的生理过程中，平衡离子与DNA之间的相互作用发挥着至关重要的作用。例如:在真核细胞内，带有大量正电的组蛋白会使DNA发生凝聚，并且组蛋白作为凝聚核；当这个凝聚体系周围的盐溶液的浓度升高时，凝聚会受到抑制，形成相对松散的凝聚结构[1-2]。带电聚电解质(例如DNA和蛋白质)与溶液中多价平衡离子作用会导致两种相互伴随的现象：凝聚和电荷逆转。对于DNA的电荷逆转和凝聚现象的深入研究不仅诠释了DNA如何参与生理过程，并且各种凝聚剂对于DNA的电荷逆转作用在基因转染过程中也已经有了广泛的应用[3]。

DNA的电荷逆转指的是，带负电DNA吸附溶液中的带有异种电荷的平衡离子，平衡离子的价态达到三价以上，便可能会使大分子表面带有的净电荷的电性发生变化[4]。在正价离子的作用下，DNA本身的形貌也会发生变化，带有负电的基因片段之间会相互吸引，线型的DNA会凝聚成球形、杆状或是“面包圈”等形状[5-6]。这两种现象是相互伴随出现的，当DNA的表面的电荷被平衡离子中和为0 的时候，相应的测量的DNA的凝聚力应该是最大的[7]。最近几十年，相当多的实验研究了DNA的电荷逆转，所使用的手段包括动态光散射(dynamiclightscattering,DLS)、荧光电泳(fluorescentmicroscopyandsinglemoleculeelectrophoresis)和原子力显微镜(atomicforcemicroscopy,AFM)。动态光散射和荧光电泳主要测量溶液中大分子的电泳迁移率和Zeta电位情况，从而确定DNA表面的净电荷量。Luan等[8]的研究指出，电泳迁移率的逆转是可以充分说明DNA表面电荷逆转的。被广泛接受的结论是三价以及高于三价的平衡离子可以引起凝聚现象，但是并没有确定的实验现象表明三价离子可以引起电荷逆转现象。

我们详细地研究了不同浓度的铁离子溶液中的DNA的电泳迁移率，以及在相应浓度下的DNA的凝聚现象，并且与三氯六氨合钴的溶液中的DNA电泳迁移和凝聚做了对比，发现铁离子引起的DNA的凝聚和电荷逆转，除了铁离子的价态，溶液的pH也是重要的影响因素。

1　原理

常用于研究DNA凝聚和电荷逆转的凝聚剂包括三氯六氨合钴、精胺(spermine)和亚精胺(spermidine)[9]。之前对于DNA的电荷逆转的研究主要使用的是一些水解较弱的离子，例如 [Ru(NH3)6]3+和[Fe(CN)6]3+等正价离子的络合物或是聚胺类物质[10]。二价的镁离子本身不会引起DNA的凝聚，但向溶液中加入高分子(聚乙二醇)也会使DNA发生凝聚[11]。当引起DNA凝聚的离子是两性离子的时候，溶液pH会对于凝聚产生较大的影响[12]。即使是精胺、亚精胺这类酸度系数(pKa)值较高的离子在作为凝聚剂时，溶液pH的升高也会抑制DNA的凝聚[13]。在不同pH的水溶液中，铁离子存在如下的水解过程：

(1)

这种水解过程一方面降低了溶液中铁离子的有效电荷，另一方面溶液中的氢离子的浓度会有所升高，会抑制以上的水解过程。水解过程中，溶液的pH会下降。当溶液的pH低于DNA的等电点时，DNA的溶解度会下降，也伴随着变性的发生。另一方面，溶液的pH也影响着铁离子在水溶液中的价态，铁离子的pK0=2.2，pK1=3.5，pK2=6.0。研究表明，在较低的溶液pH环境中的整条DNA趋于变性[14]。由于碱基对的暴露，碱基对会在较低pH的溶液中带有正电荷(DNA的等电点在4到4.5之间)。在这种情况下，DNA是否会正常的电荷逆转或者凝聚很少有相关研究涉及，这类实验在理论解释中也存在一定空白，现有的解释DNA电荷逆转或是凝聚的理论[15](Manning)都是以DNA作为一个带有面电荷密度为-1.44×10-19C/nm2的杆状模型去研究的，当DNA由于溶液pH发生变化时带电量变化或DNA变性时与平衡离子的相互作用并无相关理论涉及，所以我们对于铁离子引起的DNA的电荷逆转和凝聚的研究有重要的理论和实践意义。

2　实验方法及材料

2.1实验材料

实验中使用的氯化铁、三氯六氨合钴([Co(NH3)6]3+，cobalthexammol，Cohex)和TRIS(hydroxymethylaminoethane)等药品都购自Simga公司；使用的DNA统一为λ-phageDNA(48502bp),购自NewEnglandBiolabs；在磁镊实验中使用的PBS磷酸缓冲液含有10mmol/L的磷酸根，140mmol/L的钠离子，pH为8.0。实验中所有溶液使用去离子水配置，采用Milli-QWaterPurificationSystem(MilliporeCorporation,American)制备纯化处理。所有的实验至少重复两次，以保证其可重复性。

2.2DNA电泳迁移率的测量

采用动态光散射测量技术测量DNA在不同浓度的凝聚剂中的电泳迁移率，使用的设备为MalvernZetasizernanoZS90。Zeta电位()可以通过对于电泳迁移率的测量计算得到，Zeta电位反映的是带电大分子在溶液中的粘滞层的带电量和所带电荷的电性[16]。我们在实验过程中使用了1mmol/L，pH=8.0的TRIS缓冲液，使铁离子等水解引起的pH变化适当减弱，以便我们观察不同浓度的铁离子溶液对于DNA电泳迁移率的影响。铁离子、镧离子和三氯六氨合钴使溶液pH变化程度见表1。

表1　金属阳离子溶解在1 mmol/L的TRIS缓冲液的pH变化

2.3磁镊装置

图1　磁镊装置原理Fig.1　Schematic diagram of magnetic tweezers

凝聚力测量采用横向磁镊设备如图1所示，在磁镊实验中我们在λ-phageDNA的两端分别修饰带有单链的12个碱基对的寡核苷酸，分别带有生物素和地高辛(3’biotin-cccgccgctgga和3’digoxygenindig-tccagcggcggg)[17]。在盖玻片侧壁用砂纸磨光并修饰抗地高辛与DNA带有地高辛的一端连接，DNA另一端与修饰有链亲和素的顺磁球连接。观测顺磁球的布朗运动便可求得对于DNA施加的拉力[18]。这样操作相当于给DNA一端装上了可以操作的“手柄”。详细的实验操作可见实验小组之前发表的文章[11，19]。整个连接系统处于PBS溶液中，为了排除钠离子对于实验的影响，我们在冲入实验所用离子之前使用300μL的1mmol/LTRIS缓冲液以10μL/min的速度冲洗实验用的样品槽，样品槽的容量大约是130μL左右。

3　实验结果

3.1DNA电泳迁移率测量结果

图2中比较了不同浓度的铁离子和Cohex引起的DNA的电泳迁移率的变化。DNA电泳迁移率随着Cohex浓度的增大而升高，但并不会发生电荷逆转。而DNA在铁离子溶液中时，随着铁离子浓度的升高，DNA的电泳迁移率发生了明显的改变。在0.01mmol/L和0.1mmol/L的时候，DNA在铁离子溶液中的迁移率远低于在钴离子溶液中。当浓度升高到0.5mmol/L以上时，DNA电泳迁移率明显升高，并且发生电荷逆转。

图2　不同浓度的钴离子六胺络合物和铁离子对于DNA电泳迁移率的影响Fig.2　 Impact of different concentrations cobalt hexamine and ferric ion on electrophoretic migration rate of condensed DNA

3.2DNA力谱结果

图3a为DNA在PBS缓冲液中，最初施加在DNA上的拉力为5.6pN，每隔2min施加在DNA的拉力减小一次。图3b为DNA在1mmol/L的Cohex溶液中，以同样的方式减小对于DNA的拉力。图3c为DNA受到的拉力减小的速度更慢，在pH=3水溶液中得到的力谱。图3d为DNA在1mmol/L，pH=3的Cohex溶液中发生凝聚，减小力的过程与(c)相同。我们可以发现相对无多价离子的对照(图3a)来说，加入Cohex溶液中的DNA在大约700s时的(图3b中箭头所示)长度发生了突然的减小，此时作用在DNA上的拉力(4.5pN)我们称之为凝聚力，凝聚力的大小为DNA的自由能和长度之比。图3c显示溶液的pH降到3.0，DNA上施加的拉力慢慢减小时，DNA并不会因为溶液pH的降低发生凝聚；而在图3d中，DNA处在1mmol/L的Cohex溶液中，pH为3.0，此时DNA发生了凝聚，主要由于部分DNA发生变性，DNA净电荷量的减少，使DNA刚性受到影响，此时DNA凝聚不再有图3b中那样的台阶状的凝聚。已经有研究[20]表明，当溶液的pH较低时，常温下DNA会发生变性。

图3　DNA力谱图Fig.3　DNA force spectrum

图4a为DNA在0.1mmol/L的铁离子溶液中的力谱图，此时DNA在铁离子溶液中并无明显的凝聚现象。图4b为DNA在1mmol/L的铁离子溶液中的力谱图。图4c显示当溶液中铁离子的浓度上升到10mmol/L的时候，对DNA的拉力为18.7pN并且在施加的拉力未减小的情况下DNA发生了凝聚，DNA的长度随着时间的推移而变短。此时溶液的pH为2.35，溶液中的铁离子水解较弱，大部分应该以Fe3+的形式存在。图4d显示在10mmol/L的铁离子溶液中，DNA收缩达到稳定后，我们继续减小施加在DNA上的拉力，DNA继续凝聚。这主要因为溶液的pH低于DNA的等电点时，DNA发生了变性。图2中，1mmol/L铁离子溶液中电泳迁移率为正，表明溶液中DNA的净电荷为正；但此时DNA并未发生凝聚，二价或三价离子本身并不能使DNA发生如此明显的电荷逆转，说明部分DNA变性，碱基此时带有正电荷。这也可以很好地解释在1mmol/L铁离子溶液中的，DNA在更大拉力的作用下长度相对于0.1mmol/L时更短。此时溶液中存在两方面的机制使DNA发生凝聚，一方面溶液中的三价的铁离子浓度较高，会使DNA发生凝聚；另一方面由于溶液的pH较低，使DNA发生了变性，碱基在溶液较低pH的作用下带有正电荷提高了电荷补偿率，从而使DNA发生凝聚。

图4　DNA在铁离子溶液中的力谱图Fig.4　Force spectrum of DNA in ferric ion solution

在我们的实验中，DNA有铁离子引起的凝聚仅仅发生在浓度为10mmol/L时，此时溶液pH较低，DNA发生变性，与pH为3.0时六氨合钴所引起的DNA凝聚较为相似；与pH为8.0时，三价离子引起的DNA凝聚不同，凝聚过程不再带有台阶状的力谱。

4　结论

DNA在0.1mmol/L的铁离子溶液中并不会发生电荷逆转或凝聚，此时溶液中铁离子由于水解主要以Fe(OH)2+的形式存在；当铁离子的浓度提高到1mmol/L时，由于DNA部分发生变性且此时溶液的pH低于等电点，所以可以观测到DNA的电荷逆转和初始长度的缩短，并不会发生凝聚；当铁离子浓度上升到10mmol/L的时候，由于此时溶液中存在三价Fe3+且pH低于等电点，所以DNA会发生明显的凝聚现象，这种凝聚不仅是与三价离子引起的电荷补偿有关，DNA的变性也使凝聚的力谱发生了改变。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.018

收稿日期：2016-04-19

基金项目：国家自然科学基金(11274245, 10974146, 11304232, 11444006)

作者简介：郭子龙，男，硕士研究生，研究方向为生命现象中的凝聚态物理。 *通信作者，杨光参，Email:yanggc@wzu.edu.cn; 王艳伟，Email:wangyw@wzu.edu.cn

中图分类号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1002-4026(2016)04-0093-06

Ferric ion induced DNA charge inversion and condensation

GUO Zi-long, WANG Yan-wei*, YANG Guang-can*

(School of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China)

Abstract∶The fact that DNA is condensed into a compact structure in an organism is very important for the storage and transcription of genetic information. Previous intensive studies involve DNA condensation and associated charge inversion. Most of them highlight polyamines and worse hydrolytical ions, but less of them involve easy hydrolytical and pH greatly influenced metallic ion (such as ferric ion). We systematically investigate ferric ion induced DNA charge inversion and condensation.By comparison with cobalt hexamine, we explore a possible mechanism of ferric ion induced DNA charge inversion and condensation.

Key words∶ferric ion;DNA; charge inversion; condensation