四氢黄连碱体内抗炎作用的研究

黄慧敏，柯昌虎，陈琴华



四氢黄连碱体内抗炎作用的研究

黄慧敏，柯昌虎，陈琴华*

湖北医药学院附属东风医院实验中心,湖北 十堰 442008

[摘要]目的通过多种炎症模型观察四氢黄连碱的体内抗炎作用。方法采用由多种炎性介质参与的角叉菜胶致大鼠足肿胀模型、二甲苯致小鼠耳肿胀模型以及小鼠内毒素休克模型，从整体上评价四氢黄连碱的体内抗炎作用。角叉菜胶致大鼠足肿胀模型分为：空白对照组、四氢黄连碱高剂量组(21 mg/kg)、低剂量组(7 mg/kg)以及阳性药地塞米松组(5 mg/kg)，空白对照组给予生理盐水，其余各组给予相应剂量的药物，30 min后，足跖皮下注射角叉菜胶，并分别在致炎前及致炎后1、2、3、4、5 h测量大鼠足趾厚；二甲苯致小鼠耳肿胀模型分为：空白对照组、四氢黄连碱高剂量组(30 mg/kg)、低剂量组(10 mg/kg)以及阳性药地塞米松组(5 mg/kg)，空白对照组给予生理盐水，其余各组给予相应剂量的药物，连续给药7 d，末次给药30 min后于小鼠右耳涂抹二甲苯，左耳为对照，l h后处死，取相同部位的耳片并称重；小鼠内毒素休克模型分为：空白对照组、阴性组、四氢黄连碱高剂量组(30 mg/kg)以及低剂量组(10 mg/kg)，阴性组和空白对照组给予生理盐水，其余各组给予相应剂量的药物，给药后30 min，阴性组和四氢黄连碱组腹腔注射LPS(20 mg/kg)，空白对照组给予等体积的生理盐水，每隔12 h记录1次小鼠的存亡情况，连续观察72 h。结果角叉菜胶致大鼠足肿胀模型中，四氢黄连碱可显著抑制大鼠足肿胀，高剂量组(21 mg/kg)对足肿胀的最大抑制率达到77.82%，低剂量组(7 mg/kg)对足肿胀的最大抑制率为62.39%，和阳性药地塞米松组(5 mg/kg，最大抑制率80.54%)的作用相当；二甲苯致小鼠耳肿胀模型中，四氢黄连碱可显著抑制小鼠的耳肿胀，其中高剂量组(30 mg/kg)对耳肿胀的抑制率达到74.03%，低剂量组(10 mg/kg)对耳肿胀的抑制率为53.93%，和阳性药地塞米松组(5 mg/kg，抑制率64.71%)的作用相当；四氢黄连碱可显著性提高内毒素休克小鼠的存活率，其中高剂量组(30 mg/kg)内毒素休克小鼠72 h内的存活率为70%，低剂量组(10 mg/kg)为40%，四氢黄连碱组的存活率与阴性组(30%)相比差异有统计学意义。结论四氢黄连碱具有较强的抗炎、抗内毒素休克作用，且抗炎机制可能与抑制炎性物质的渗出和炎症细胞因子的分泌有关。

[关键词]四氢黄连碱；抗炎；足肿胀；耳肿胀；内毒素休克模型

0　引言

四氢黄连碱是从我国传统中药如夏天无、延胡索、紫堇等植物中提取分离得到的一种原小檗碱型生物碱，目前对四氢黄连碱的研究多集中于含量测定方法的建立，对其生物活性尤其是抗炎活性的研究较少，故本研究通过角叉菜胶致大鼠足肿胀模型、二甲苯致小鼠耳肿胀模型以及小鼠内毒素休克模型，对四氢黄连碱的体内抗炎作用进行初步研究，从而丰富了四氢黄连碱的研究范围。

1　材料

1.1实验动物健康昆明种小鼠，20～25 g，SD大鼠，200～250 g，清洁级动物，由西安交通大学动物中心提供。

1.2实验药物及制备

1.2.1实验药物四氢黄连碱(宝鸡市辰光生物工程有限公司，含量>98%)；地塞米松注射液(山西晋新双鹤药业有限责任公司)；脂多糖(Sigma，美国)；氯化钠(西安化学试剂厂)；肿瘤坏死因子-α试剂盒(Rapidbio，美国)；二甲苯(西安化学试剂厂)；角叉菜胶(Sigma，美国)

1.2.2主要试剂的配制四氢黄连碱的配制：称取四氢黄连碱40 mg，加0.1%的CMC-Na 20 mL，充分溶解制成浓度为2 mg/kg的溶液，储存在4 ℃备用；LPS的配制：用三蒸水配制成2 mg/mL的母液，临用前稀释成所需浓度；1%角叉菜胶的配制：称取适量的角叉菜胶，缓慢加入到0.9%的生理盐水中，不断搅拌，充分溶解后储存于4 ℃备用。

2　方法

2.1四氢黄连碱对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响取健康SD大鼠24只，体重200～250 g，雌雄各半，分为4组，每组6只，分别为：空白对照组，四氢黄连碱高剂量组(21 mg/kg)，四氢黄连碱低剂量组(7 mg/kg)，地塞米松组(5 mg/kg)，给药剂量见表1。实验组大鼠腹腔注射给药，空白对照组注射等体积的生理盐水，给药后30 min，于每只大鼠的右后足跖皮下注射100 μL浓度为1%的角叉菜胶致炎，并分别在致炎前、致炎后1、2、3、4、5 h测量大鼠右后足趾厚。大鼠的足肿胀参照以下公式计算[1]：

肿胀度(mm)=Tt-T0

足肿胀抑制率(%)=

其中，T0表示注射角叉菜胶前大鼠右后足趾的厚度，Tt表示注射角叉菜胶后大鼠在t时的右后足趾厚度。

2.2四氢黄连碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响取体重20～25 g昆明种雄性小鼠，随机分为4组，每组6只，即空白对照组，四氢黄连碱高剂量组(30 mg/kg)，四氢黄连碱低剂量组(10 mg/kg)，地塞米松组(5 mg/kg)。实验组每天腹腔注射给药，空白对照组给予等体积的生理盐水，连续给药7 d，末次给药30 min后，立即在小鼠右耳正反面均匀涂抹二甲苯各20 μL，左耳为对照。1 h后，乙醚麻醉并脱颈处死，立即沿着耳廓基线剪下双耳，并用点径为9 mm的打孔器取相同部位的耳片，于万分之一分析天平上称重，计算肿胀度[2-3]：肿胀度(mg)=右耳片重-左耳片重；肿胀抑制率(%)=(对照组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度)/对照组平均耳肿胀度×100%

2.3四氢黄连碱对内毒素休克小鼠存活率的影响取体重20～25 g的健康昆明种雄性小鼠100只，随机分为5组，每组24只，分别为：空白对照组，阴性组，四氢黄连碱高剂量组(30 mg/kg)和四氢黄连碱低剂量组(10 mg/kg)。实验组大鼠腹腔注射给药，阴性组和空白对照组注射等体积的生理盐水，给药后30 min，阴性组和四氢黄连碱组腹腔注射LPS(20 mg/kg)，空白对照组注射等体积的生理盐水。此后每隔12 h记录1次小鼠的存亡情况，连续观察72 h。

2.4四氢黄连碱对内毒素休克小鼠血清中TNF-α含量的影响取体重20～25 g的健康昆明雄性小鼠100只，随机分为5组，每组24只，分别为：空白对照组，阴性组，四氢黄连碱高剂量组(30 mg/kg)和四氢黄连碱低剂量组(10 mg/kg)。实验组大鼠腹腔注射给药，阴性组和空白对照组注射等体积的生理盐水，给药后30 min，阴性组和四氢黄连碱组腹腔注射LPS(20 mg/kg)，空白对照组注射等体积的生理盐水。在注射LPS的0、1、3、6 h处每组分别随机取出6只小鼠，摘除眼球取血，于4 ℃ 4 500 r/min条件下离心10 min，收集血清并储存于-20 ℃，待测TNF-α，测定方法详见说明书。

3　结果

3.1四氢黄连碱对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响四氢黄连碱对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀的影响用肿胀抑制率和肿胀度来评价，结果见表1。与对照组相比，四氢黄连碱高(21 mg/kg)、低(7 mg/kg)剂量组对角叉菜胶引起的大鼠足肿胀具有显著的抑制作用。角叉菜胶致炎后3 h，足肿胀达到最大值。四氢黄连碱高、低剂量组以及地塞米松组对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的抑制率在致炎后1 h到达最大值，分别为77.82%(P<0.01)、62.39%(P<0.01)和80.54%(P<0.01)。

表1　四氢黄连碱对角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的作用(n=6)

注：与对照组比较，**P<0.01

3.2四氢黄连碱对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响应用耳肿胀度评价四氢黄连碱对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的抑制作用，结果见表2。与对照组比较，四氢黄连碱高(30 mg/kg)、低(10 mg/kg)剂量组和地塞米松组(5 mg/kg)均能显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀，且高剂量组的抑制作用强于阳性药，抑制率分别为74.03%(P<0.01)、53.93%(P<0.01)和64.71%(P<0.01)。

3.3四氢黄连碱对内毒素休克小鼠存活率的影响实验表明，实验组小鼠腹腔注射LPS 12 h后出现死亡，48 h后死亡趋于稳定。四氢黄连碱处理组可显著提高内毒素休克小鼠72 h内的存活率：其中高剂量组(30 mg/kg)的存活率为70%，低剂量组(10 mg/kg)为40%，存活率与阴性组(30%)相比差异均有统计学意义，结果见图1。

表2　四氢黄连碱对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的作用

注：与对照组比较，**P<0.01

3.4四氢黄连碱对内毒素休克小鼠血清TNF-α含量的影响实验表明，四组小鼠在注射LPS前血清中TNF-α的含量差异无统计学意义，实验组小鼠腹腔注射LPS后，血清中TNF-α含量均急剧上升，但与阴性组相比，经四氢黄连碱处理的小鼠血清中TNF-α的上升趋势被显著抑制，结果见图2。

图1　四氢黄连碱对内毒素休克小鼠存活率的影响

*P<0.05，**P<0.01

图2　四氢黄连碱对内毒素休克小鼠血清中TNF-α含量的影响

图2　四氢黄连碱对内毒素休克小鼠血清中TNF-α含量的影响

**P<0.01

4　讨论

炎症是机体对损伤因子做出的复杂的防御反应，是集损伤、抗损伤和修复为一体的综合过程，药理研究中观察一个药物是否具有抗炎作用，首先应在实验动物上造炎症模型。常见的炎症模型分为非特异性炎症模型和免疫性炎症模型两大类，前者分为急性炎症模型与慢性炎症模型。急性炎症模型又分为：①以毛细血管通透性改变为主要特征的炎症模型，常见的如醋酸致小鼠腹腔毛细血管的通透性升高；②以局部肿胀为主要特征的炎症模型，常见的如大鼠蛋清、角叉菜胶型肿胀；③以白细胞游走、渗出为主要特征的炎症模型，常见的如大鼠角叉菜胶胸膜炎[4-7]。结合已知的四氢黄连碱研究现状，我们选用了角叉菜胶诱导大鼠足肿胀模型、二甲苯致小鼠耳肿胀模型、LPS诱导小鼠内毒素休克模型，对四氢黄连碱的抗炎作用进行了较为全面的研究。

角叉菜胶致大鼠足肿胀模型是常用于评价或筛选药物抗炎作用的经典急性炎症模型，当大鼠足跖内注射角叉菜胶时，能诱导大鼠局部毛细血管扩张，增加血管通透性、渗出、水肿等一系列与人体急性炎症相似的反应，由于该模型稳定，重现性好，常用于筛选抗炎药物[7-9]。因此，本研究采用角叉菜胶致大鼠足肿胀模型，观察四氢黄连碱的抗炎作用。结果显示：注射角叉菜胶后，大鼠足部即开始发生炎症并肿胀，致炎后3 h足肿胀达到高峰，此结果与国外相关报道较接近[10-12]，四氢黄连碱(21 mg/kg，7 mg/kg)预防性给药对角叉菜胶所致大鼠足肿胀有显著的抑制作用，且有一定的剂量相关性，其预防效果在致炎后1 h达到最大值，对足肿胀的抑制率分别为77.82%和62.39%，其中高剂量(21 mg/kg)的抑制率(77.82%)和阳性药地塞米松的抑制率(80.54%)相当。

二甲苯诱导小鼠耳肿胀模型是常用的急性炎症模型之一，其作用机制是引起小鼠耳部局部皮肤血管扩张，增加血管通透性，使大量炎症介质如前列腺素、组胺、血清素等渗出，从而造成耳部急性渗出性炎症水肿[13]。在二甲苯致小鼠耳肿胀模型中，四氢黄连碱(30 mg/kg，10 mg/kg)可显著抑制小鼠的耳肿胀，其中高剂量组(30 mg/kg)对耳肿胀的抑制率达到74.03%，预防效果明显高于阳性药地塞米松(64.71%)，其作用机制可能与抑制血管通透性以及抑制血管内容物的渗出有关。

内毒素休克过程中往往伴有炎性介质如TNF-α、IL-6的失控性释放，这些细胞因子在内毒素休克中发挥着重要的作用，可以引起肺组织淋巴细胞的浸润，由淋巴细胞释放的炎症因子又可引起酸中毒和组织损伤，并最终导致器官功能障碍，甚至死亡[14-16]。细胞因子TNF-α是在炎症早期产生的，是炎症反应中激活细胞因子级联反应的主要介质，可在循环中较早出现并且迅速达到高峰，从而启动其他一系列的细胞因子如IL-6的产生和释放[17]。本研究发现，四氢黄连碱可明显提高内毒素休克小鼠存活率，30 mg/kg四氢黄连碱组内毒素休克小鼠的存活率达到70%；同时，我们用ELISA试剂盒检测了内毒素休克模型小鼠血清中TNF-α的含量，结果显示，经LPS刺激；小鼠血清中TNF-α的含量显著升高，并在造模后1 h时达到峰值，四氢黄连碱预防性给药，可显著抑制内毒素休克小鼠血清中TNF-α的含量，并呈剂量依赖性，此结果和四氢黄连碱可提高内毒素休克小鼠的存活率相一致。

综上所述，四氢黄连碱具有较强的抗炎、抗内毒素休克作用，且抗炎机制可能与抑制炎性物质的渗出和炎症细胞因子的分泌有关。

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收稿日期：2015-11-03

基金项目：十堰市科学技术研究与开发项目(15Y48)；湖北省自然科学基金面上基金(2015CFB615)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607010

Study on the anti-inflammatory activities of tetrahydrocoptisineinvivo

HUANG Hui-min,KE Chang-hu,CHEN Qin-hua*

(Affiliated Dongfeng Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442008,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the anti-inflammatory effects of tetrahydrocoptisine in vivo by inflammatory models.MethodsThe acute inflammatory models of paw edema induced by carrageenan in rats,xylene-induced ear swelling models and endotoxin LPS-induced shock models in mice were observed in order to investigate the anti-inflammatory effects of tetrahydrocoptisine.The model rats of paw edema induced by carrageenan were randomly divided into four groups:blank control group,high dosage group of tetrahydrocoptisine (21 mg/kg),low dosage group of tetrahydrocoptisine (7 mg/kg) and dexamethasone group (5 mg/kg).Rats were treated(i.p.) with tetrahydrocoptisine,dexamethasone or an equal volume of saline 30 min prior to receiving carrageenan in the right hind paw.The thickness of the paw was measured before and at 1,2,3,4 and 5 h after the injection of carrageenan with a micrometer.In ear swelling models induced by xylene,mice were randomly divided into four groups:blank control group,high dosage group of tetrahydrocoptisine (30 mg/kg),low dosage group of tetrahydrocoptisine (10 mg/kg) and dexamethasone group (5 mg/kg).Two doses (10 and 30 mg/kg) of tetrahydrocoptisine were administered (i.p.) to the two test groups,respectively.Dexamethasone group and blank control group were given dexamethasone (5 mg/kg) or the same volume of saline for 7 days.After the final treatment,xylene was applied to surfaces of the right ear of each animal.One hour after treatment with xylene,animals were killed by cervical dislocation and both ears were removed.Ear punch biopsies were collected and weighed.In the model of endotoxins shock of mice,four groups of mice were used:blank control group,negative group,high dosage group of tetrahydrocoptisine (30 mg/kg) and low dosage group of tetrahydrocoptisine (10 mg/kg).The two test groups received i.p.injection of tetrahydrocoptisine and the negative group received saline at 30 min before injection (i.p.) of 20 μg/kg LPS,while blank control group received an equal volume of saline.The survival rate of mice was recorded every 12 h,continuously for 72 h.ResultsTetrahydrocoptisine could inhibit the rat paw edema induced by carrageenan with the inhibition rate being 77.82% (21 mg/kg) and 62.39% (7 mg/kg),which was as effective as the dexamethasone (5 mg/kg,80.54%).Tetrahydrocoptisine could inhibit the mouse ear swelling induced by xylene with the inhibition rate being 74.03% (30 mg/kg) and 53.93%(10 mg/kg),which had the same efficacy as dexamethasone (5 mg/kg,64.71%).Tetrahydrocoptisine significantly improved the survival rate of mice with endotoxic shock with the rate being 70% in high dosage group of tetrahydrocoptisine (30 mg/kg) and 40% in low dosage group of tetrahydrocoptisine (10 mg/kg),which showed significant differences when compared with negative control group(30%).ConclusionTetrahydrocoptisine possesses obvious anti-inflammatory activity and protects the mice against LPS-induced endotoxic shock,which may be related to the inhibition of the overproduction of inflammatory cytokines.

Key words：Tetrahydrocoptisine;Anti-inflammatory;Paw edema;Ear swelling;Endotoxin-induced shock model