HIF-1α和Rac1在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义*

陈　瑛，敖启林，黄　磊，宁　杨，李　莉，王玉兰，李　瑞，田　训，李贺梅，张庆华△

(1.华中科技大学附属武汉中心医院妇产科，武汉 430014；2.华中科技大学附属同济医院病理科，武汉 430000)



HIF-1α和Rac1在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义*

陈瑛1，敖启林2，黄磊1，宁杨1，李莉1，王玉兰1，李瑞1，田训1，李贺梅1，张庆华1△

(1.华中科技大学附属武汉中心医院妇产科，武汉 430014；2.华中科技大学附属同济医院病理科，武汉 430000)

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(Rac1)在宫颈上皮内瘤变(CIN)和鳞状细胞癌中的表达以及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测正常宫颈组织20例、宫颈CIN 42例(CINⅠ级12例，CINⅡ～Ⅲ级30例)、宫颈鳞状细胞癌58例(高分化15例，中分化24例，低分化19例)中HIF-1α和Rac1蛋白的表达情况，以分析其表达与临床病理特征的关系，并结合临床资料进行分析。结果HIF-1α蛋白在正常宫颈黏膜组织中的阳性表达率为0%(0/20)，CINⅠ级组织阳性表达率为16.7%(2/12)，CINⅡ～Ⅲ级组织阳性表达率为56.7%(17/30)，宫颈鳞状细胞癌组织阳性表达率为81.0%(47/58)，其中高分化阳性表达率53.3%，中分化阳性表达率83.3%，低分化阳性表达率100%。HIF-1α蛋白在宫颈鳞状细胞癌发生发展中的表达依次升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。且宫颈鳞状细胞癌组织中HIF-1α蛋白表达与其组织学分级、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。Rac1蛋白表达在正常宫颈黏膜组织中的阳性表达率为0%(0/20)，宫颈CINⅠ级组织阳性表达率为8.3%(1/12)，宫颈CINⅡ～Ⅲ级组织阳性表达率为53.3%(16/30)，宫颈鳞状细胞癌组织阳性表达率为77.6%(45/58)，其中高分化阳性表达率60.0%，中分化阳性表达率73.0%，低分化阳性表达率94.7%。Rac1蛋白在宫颈癌发生发展中的表达依次升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。且宫颈鳞状细胞癌组织Rac1蛋白表达与其组织学分级、TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05)。HIF-1α蛋白的阳性表达率与Rac1蛋白的阳性表达率呈正相关(r=0.3，P<0.05)。结论HIF-1α及Rac1联合检测蛋白表达有助于判断宫颈鳞状上皮肿瘤的病变程度及预后。

宫颈鳞状细胞癌；缺氧诱导因子-1α；Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1

宫颈癌是全球女性最常见的妇科恶性实体肿瘤，严重威胁女性健康。我国每年新增宫颈癌病例约13.5万，占全球发病数量的1/3。缺氧是恶性实体瘤的基本特征之一，在缺氧环境中处于核心地位的缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一种异源二聚体蛋白复合物，由α和β两个蛋白亚基组成，HIF-1α在动物及人体的多种肿瘤组织中呈过度表达，促进血管形成，维持肿瘤细胞的能量代谢,影响肿瘤的生长、转移和凋亡[1]。Ras 相关 C3 肉毒杆菌毒素底物 1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是小G蛋白Rho家族的重要成员，在肿瘤组织中激活状态的Rac1通过参与细胞骨架重组、基因转录调控和细胞信号转导等生理过程[2]，影响肿瘤细胞的极性、黏附、生长和运动能力，而且越来越多的证据显示Rac1能被缺氧激活[3]，在诱导HIF-1α转录活性增强过程中发挥关键作用[4]。

本研究拟对HIF-1α、Rac1蛋白在各种程度宫颈鳞状细胞病变中的表达及其相关性进行研究，探索其与临床病理参数的关系，为探讨新的宫颈癌诊断和治疗靶点提供理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料收集武汉市中心医院2009年7月至2011年6月手术切除的宫颈组织共120例，其中子宫良性病变患者手术切除后的正常宫颈组织20例、宫颈上皮内瘤变(CIN)42例(CINⅠ级12例、CINⅡ和Ⅲ级30例)、宫颈鳞状细胞癌58例，患者平均年龄49.2岁，58例宫颈鳞状细胞癌患者术前均未接受放疗、化疗。组织学分级根据世界卫生组织2003年肿瘤细胞分化程度分类标准：低分化癌19例，中分化癌24例，高分化癌15例。TNM分期根据FIGO 2000年修订的标准：Ⅰ期22例，Ⅱ期24例，Ⅲ期8例，Ⅳ期4例，无淋巴结转移者37例，有淋巴结转移者21例。上述所有病例的诊断均经1～2位有丰富临床病理诊断经验的高级职称病理医师证实。

1.2试剂鼠抗人HIF-1α单克隆抗体为Neomarker公司产品，鼠抗人Rac1 单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒、二甲苯、乙醇、PBS缓冲液pH7.4，乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液pH9.0、过氧化氢、苏木素、1%盐酸酒精等。

1.3免疫组织化学检测上述组织标本均置于10%甲醛溶液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋后4 μm连续切片，进行HE染色和免疫组织化学染色。鼠抗人HIF-1α单克隆抗体工作浓度为1∶50，鼠抗人Rac1单克隆抗体工作浓度为1∶50，梯度乙醇(100%、95%、80%、70%)。

1.4免疫组织化学结果判断HIF-1α和Rac1的结果判定标准:HIF-1α的阳性表达为细胞核或胞质被染成浅黄色、棕黄色或黄褐色颗粒。Rac1蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞的细胞质中，呈浅黄色或深黄色。

按染色强度计分:无染色计0分,轻度染色计1分,中度染色计2分,强染色计3分;按阳性染色细胞百分率计分:阳性细胞数小于或等于10%计0分,阳性细胞数>10%～25%计1分,阳性细胞数>25%～50%计2分,阳性细胞数大于50%计3分。然后将两类计分结果的乘积得分分为以下等级:0分为-,1～2分为+,3～4分为++,5～6分为+++。设定+～+++为阳性表达,-为阴性表达。

1.5统计学处理所有数据用SPSS13.0统计学软件进行处理，应用χ2检验分析HIF-1α和Rac1在各宫颈组织中的表达，应用Spearman等级相关性分析进行HIF-1α和Rac1的相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1HIF-1α及Rac1在正常宫颈组织、宫颈CIN组织和宫颈鳞状细胞癌组织中的表达HIF-1α及Rac1其在各组宫颈病变中表达情况见表1和图1。HIF-1α及Rac1在正常宫颈组织中无表达，HIF-1α在CINⅠ级、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈鳞状细胞癌中的阳性表达率(16.7%、56.7%、81.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2HIF-1α及Rac1与宫颈鳞状细胞癌的组织学分级、分期及淋巴转移的关系在不同临床分期的宫颈鳞状细胞癌中,HIF-1α在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率(78.3%vs. 91.7%)差异有统计学意义(P<0.05)；Rac1在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的阳性表达率(73.9%vs. 91.7%)差异有统计学意义(P<0.05)，随期别的进展而升高(表2)。

图1　　HIF-1α及Rac1在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈鳞状细胞癌组织中的表达(SP×100)

组别nHIF-1α阴性阳性阳性率(%)PRac1阴性阳性阳性率(%)P正常宫颈组织202000<0.052000<0.05CINⅠ1210216.71118.3CINⅡ～Ⅲ30131756.7141653.3宫颈鳞状细胞癌组织58114781.0134577.6

表2　　HIF-1α和Rac1蛋白表达与宫颈鳞状细胞癌临床病理特征的关系

Rac1在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈鳞状细胞癌的阳性表达率(8.3%、53.3%、77.6%)，差异有统计学意义(P<0.05)。在不同组织学分化程度的宫颈鳞状细胞癌中,HIF-1α在低分化组、中分化组、高分化组的阳性表达率(100.0%、83.3%、53.3%)差异有统计学意义(P<0.05)， Rac1在低分化组、中分化组、高分化组的阳性表达率(94.7%、75.0%、60.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。58例宫颈鳞状细胞癌患者中，有淋巴结转移者的HIF-1α及Rac1阳性表达率均高于无淋巴结转移者。

2.3在宫颈CIN组织和宫颈鳞状细胞癌组织中HIF-1α和Rac1表达的相关性42例宫颈CIN组织中，Rac1和HIF-1α蛋白共同表达阳性14例，共同表达阴性20例，采用Spearman等级相关性分析，Rac1和HIF-1α蛋白的表达呈正相关(r=0.3,P<0.05)见表3。

表3　　宫颈CIN组织中HIF-1α和Rac1蛋白表达的关系(n)

58例宫颈鳞状细胞癌组织中，Rac1和HIF-1α蛋白共同表达阳性40例，共同表达阴性6例，采用Spearman等级相关性分析，Rac1和HIF-1α蛋白的表达呈正相关(r=0.3，P<0.05)，见表4。

表4　　宫颈鳞状细胞癌组织中HIF-1α和Rac1蛋白表达的关系(n)

3　讨　　论

HIF-1α尽管在正常氧浓度下也表达,但很快可被泛素蛋白酶体系统所降解;而在缺氧状态时其降解过程被阻断,导致HIF-1α在核内蓄积,与β蛋白亚基结合，形成有活性的HIF-1,启动多种下游基因[5],使细胞适应缺氧状态，促进肿瘤细胞的生长和分裂，而且可通过减少有氧代谢中反应性氧类对细胞 DNA 复制的破坏，促进肿瘤的增殖和转移。

大量免疫组织化学实验已证明，HIF-1α 在人类多种肿瘤中表达增加，HIF-1α通过调节不同靶基因的转录活性及其自身的表达，参与肿瘤的增殖凋亡与侵袭转移等过程，其过度表达与恶性肿瘤的不良预后有关[6]。本实验研究结果也显示：HIF-1α蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达远高于宫颈CIN组织及正常子宫颈组织，且宫颈鳞状细胞癌组织HIF-1α表达与浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关，说明HIF-1α蛋白高表达的宫颈鳞状细胞癌具有更强的侵袭能力，提示HIF-1α其过度表达可能与宫颈癌不良预后有关，对其表达程度的检测具有重要的生物学和临床价值。

Rac-1 基因位于人染色体7p22，有Rac1、Rac2、Rac3 3个亚型。Rac1蛋白可广泛表达于机体各组织中，通过结合或水解GTP 核苷酸，在GDP 结合形式( 失活状态)与 GTP 结合形式( 激活状态) 之间相互转换[7]。肿瘤组织中活性形式的Rac1蛋白参与调节细胞丝状伪足的生成以及膜皱缩[7-9],调节肿瘤细胞的运动，影响肿瘤的生长。此外，Rac1还通过增加细胞内超氧化物阴离子，抑制肿瘤细胞发生凋亡[10]，对肿瘤的发展及侵袭转移起着重要的作用。

目前大多数试验表明Rac1与人类恶性肿瘤的发生发展有着密切的关系，在多种恶性肿瘤中呈过表达，Rac1在肿瘤及其增殖、转移过程中起着重要作用[11]。本试验研究结果表明在宫颈鳞状细胞癌组织中Rac1的表达高于宫颈CIN组织，且与浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关。宫颈CIN组织中高级别病变的Rac1表达高于低级别病变，高于正常宫颈组织。

近年来有研究发现在某些恶性肿瘤中存在HIF-1α和Rac1蛋白共同表达的情况， Rac1通过抑制VHL蛋白水平可在低氧环境中增加HIF-1α的稳定性,进一步促进肿瘤血管的生成[12]。此外Rac1是HIF-1α的上游调控基因，Rac1可通过结合蛋白激酶调节缺氧引起的HIF-1及HIF-1 相关蛋白的磷酸化和氧化还原反应，从而参与HIF-1α的活化，促进其表达[13]。Rac1通过激活p38MAPK 活化HIF-1α末端活性区(TAD),从而提高了HIF-1的转录活性。DU等[14]研究发现Rac1在人类乳腺癌中能激活促进HIF-1α的表达。本研究分析显示， HIF-1α与Rac1的表达在宫颈癌前病变及宫颈鳞状细胞癌中呈正相关(r=0.3,P<0.05),且随宫颈病变的进展而变化的趋势也基本一致，提示HIF-1α与Rac1可能有着较密切的联系。

综上所述,HIF-1α和Rac1在宫颈癌前病变及宫颈鳞状细胞癌组织中的表达水平均明显增高，浸润深度越深，分化程度越低，表达水平越高。且在宫颈鳞状细胞癌组织中二者的表达呈正相关，提示在宫颈鳞状细胞癌的病理演变过程中，HIF-1α与Rac1相互间可能存在协同调控作用，促进了宫颈癌的进展及转移。分析二者协同作用的机制可能为肿瘤组织中Rac1通过激活p38MAPK活化HIF-1α末端活性区(TAD)，提高了HIF-1α的转录活性[4]，且通过抑制VHL蛋白水平在低氧状态下增加了HIF-1α的稳定性[15]。

总之，HIF-1α及Rac1的联合检测有助于判断宫颈上皮内瘤变的病变程度，评价宫颈鳞状细胞癌的生物学行为和预后，为其早期诊断和治疗提供理论依据。

[1]Brown JM.Exploiting the hypoxic cancer cell:mechanisms and therapeutic strategies[J].Mol Med Tod,2000,6(4):157-162.

[2]Gómez Del Pulgar T,Bandrés E,Espina C,et al.Differential expression of Rac1 identifies its target genes and its contribution to progression of colorectal cancer[J].Int J Biochem Cell Biol,2007,39(12):2289-2302.

[3]Turcotte S,Desrosiers RR,Béliveau R.HIF-1alpha mRNA and protein upregulation involves Rho GTPase expression during hypoxia in renal cell carcinoma[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 11):2247-2260.

[4]Hirota K,Semenza GL.Rac1 activity is required for the activation of hypoxia-inducible factor 1[J].J Biol Chem,2001,276(24):21166-21172.

[5]Semenza GL.Targeting HIF-1 for cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2003,3(10):721-732.

[6]周明利．HlF-1α与EMT在肿瘤中的作用及意义研究进展[J]．中国普通外科杂志，2012，21(9)：1132-1136．

[7]Heasman SJ,Ridley AJ.Mammalian Rho GTPases:new insights into their functions from in vivo studies[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2008,9(9):690-701.

[8]Ridley AJ,Schwartz MA,Burridge K,et al.Cell migration:Integrating signals from front to back[J].Science,2003,302(5651):1704-1709.

[9]Del Pozo MA,Alderson NB,Kiosses WB,et al.Integrins regulate Rac targeting by internalization of membrane domains[J].Science,2004,303(5659):839-842.

[10]Pervaiz S,Cao J,Chao OS,et al.Activation of the RacGTPase inhibits apoptosis in human tumor cells[J].Oncogene,2001,20(43):6263-6268.

[11]田锐，郭兴军，江建新，等．Rac1对胰腺癌增殖的影响及其机制[J]．世界华人消化杂志，2013，21(12)：1070-1074．

[12]Terence K,Ronnie T,Anthony P,et al.Rac activation is associated with hepatocellular carcinoma metastasis by up-regulation of vascular endothelial growth factor expression[J].Clin Cancer Res,2006,12(17):5082-5089.

[13]郝晓凤，惠延年，王雨生，等．Rac1和HIF-1在激光诱导小鼠脉络膜新生血管模型组织中的表达[J]．眼科新进展，2007，27(6)：401-404．

[14]Du J,Xu R,Hu Z,et al.PI3K and ERK-induced Rac1 activation mediates hypoxia-induced HIF-1α expression in MCF-7 breast cancer cells[J].PLoS One,2011,6(9):e25213.

[15]Terence K,Ronnie T,Anthony P,et al.Rac activation is associated with hepatocellular carcinoma metastasis by up-regulation of vascular endothelial growth factor expression[J].Clin Canaer Res,2006,12(17):5082-5089.

武汉市卫生局临床医学科研项目资助(WX11B05)。作者简介：陈瑛(1979-)，主治医师，硕士，主要从事妇科肿瘤方面的研究。△

，E-mail:zhangqh66@qq.com。

R711.74

B

1671-8348(2016)20-2828-04

2016-02-11

2016-04-18)

·经验交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.030