全反式维甲酸对高糖环境下HK-2细胞转分化的影响及其可能机制

秦晓华，陈艳霞，涂卫平，黄　翀，房向东，邹宏昌，徐承云

(南昌大学第二附属医院肾内科　330006)



全反式维甲酸对高糖环境下HK-2细胞转分化的影响及其可能机制

秦晓华，陈艳霞，涂卫平△，黄翀，房向东，邹宏昌，徐承云

(南昌大学第二附属医院肾内科330006)

目的探讨全反式维甲酸(ATRA)对高糖环境下正常人肾小管上皮HK-2细胞株转分化的影响及其可能机制。方法将体外培养的HK-2 细胞按随机数字表法分为以下7组：空白组、高糖组、高渗组、高糖+低浓度ATRA组、高糖+中浓度ATRA组、高糖+高浓度ATRA组、Rho激酶抑制剂Y27632干预组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞 RhoA及ROCK1 mRNA表达水平，采用细胞免疫荧光检测高糖环境下HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 及E-钙黏蛋白的表达变化。结果RT-PCR结果显示：空白组与高渗组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；高糖组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平较空白组、高渗组高，差异均有统计学意义(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干预后，RhoA及ROCK1 mRNA表达较高糖组减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，且呈现ATRA浓度依赖性。相关性分析示，高糖组及各ATRA干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关(P<0.05)。细胞免疫荧光检测结果显示：空白组与高渗组α-SMA及E-钙黏蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；高糖组α-SMA表达水平较空白组高，E-钙黏蛋白表达水平较空白组低，差异均有统计学意义(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干预后，α-SMA表达明显减少，E-钙黏蛋白表达明显增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ATRA可部分逆转高糖环境下HK-2细胞转分化的过程，其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

全反式维甲酸；肾小管上皮细胞；α-平滑肌肌动蛋白；E-钙黏蛋白；RhoA/Rho激酶信号通路

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并发症之一，其主要特点是蛋白尿并伴有肾小球滤过率下降。全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是维生素A的活性代谢产物，在机体中能诱导细胞生长、分化及凋亡，同时其在基因调节方面也起着重要作用[1]。最近研究报道，ATRA由于能减少转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达，抑制单核细胞趋化肽1的上调，被认为具有缓解肾损伤，保护肾脏的作用[2]。然而，其具体作用机制仍在探索之中。本试验以人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)为研究对象，探索ATRA对RhoA/Rho激酶(ROCK)信号通路的影响，进一步探索其保护肾脏的可能机制，为临床治疗DN提供新思路。

1　材料与方法

1.1细胞来源人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞株)购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

1.2仪器与试剂ATRA、Rho激酶抑制剂Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美国Sigma公司)； DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)/F12培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(BSA)、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；Trizol、引物(美国Invitrogen公司)；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(北京全式金公司)。核酸微量蛋白测定仪、PCR扩增仪、凝胶图像成像系统(美国Bio-Rad公司)，DYPC-31DN型电泳仪(北京六一仪器厂)，鼠抗人单克隆α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)抗体、鼠抗人单克隆E-钙黏蛋白(epithelial- cadherin，E-cadherin)抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司)。

1.3方法

1.3.1细胞培养及试验分组HK-2细胞培养条件：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37 ℃ 5% CO2培养箱培养。待HK-2细胞在培养瓶中生长至70%～80%融合时进行传代，传代后生长至约80%融合后改用无血清DMEM/F12继续培养24 h。将体外培养的HK-2细胞按随机数字表法分为以下7组：(1)空白组；(2)高糖组(D-葡萄糖浓度为30 mmol/L)；(3)高渗组(甘露醇浓度为24.5 mmol/L)；(4)高糖+低浓度ATRA组(ATRA浓度为10-7mol/L)、(5)高糖+中浓度ATRA组(ATRA浓度为10-6mol/L )、(6)高糖+高浓度ATRA组(ATRA浓度为10-5mol/L)；(7)Rho激酶抑制剂Y27632干预组(高糖+Y27632，Y27632浓度为30 μmol/L)，予以高糖培养30 min后再加入Y27632进行干预。各试验组细胞干预48 h，试验重复3 次。

1.3.2RT-PCR检测收集各组细胞总RNA，检测RNA完整性后测定RNA浓度。取总RNA 1.5 μg进行逆转录反应合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR Super Mix的作用下扩增目标基因，总反应体系50 μL。PCR扩增条件： 94 ℃预变性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35个循环。PCR产物电泳仪内120 V，电泳30 min，凝胶成像系统成像并使用Quantity One软件进行数据分析。RhoA、ROCK1及β-肌动蛋白(β-actin)引物序列及产物长度，见表1。

1.3.3细胞免疫荧光6孔培养板中的细胞用4%多聚甲醛固定20 min(置于4 ℃冰箱)，用0.1% Triton穿孔15 min，5% BSA封闭液室温封闭30 min后，各孔中滴加鼠抗人单克隆α-SMA 抗体(抗体按1∶200稀释，5% BSA封闭液配制)或鼠抗人单克隆 E-cadherin抗体4 ℃孵育过夜后取出室温恢复30 min，加入FITC标记抗小鼠IgG二抗，置37 ℃孵箱孵育30 min，荧光显微镜下观察。每组细胞随机选取10个视野摄像，荧光图片用 Image-Pro Plus 6.0软件分析，每个视野积分吸光度值与测量面积的比值为平均荧光强度(即蛋白相对表达量)。

表1　　RhoA、ROCK1及β-actin引物序列和产物长度

2　结　　果

2.1各组HK-2细胞RhoA及ROCK1 mRNA表达水平比较空白组与高渗组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；高糖组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平较空白组、高渗组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干预组RhoA及ROCK1 mRNA表达水平较高糖组减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，且呈现ATRA浓度依赖性。见图1、表2。

M：蛋白质标记物；1：空白组；2：高糖组；3：高渗组；4：高糖+低浓度ATRA组；5：高糖+中浓度ATRA组；6：高糖+高浓度ATRA组；7：Y27632干预组。

图1各组HK-2细胞RhoA mRNA及ROCK1mRNA的表达情况

2.2相关性分析Pearson直线相关分析示：高糖组及各ATRA干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关(P<0.05)。

表2　　各组HK-2细胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表达水平比较

续表2　　各组HK-2细胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表达水平比较

*：P<0.05，与空白组比较；#：P<0.05，与高糖组比较；△：P<0.05，与高糖+低浓度ATRA组比较；▽：P<0.05，与高糖+中浓度ATRA组比较。

表3　　RhoA mRNA与ROCK1 mRNA的相关性

2.3各组HK-2细胞α-SMA及E-cadherin表达水平比较细胞免疫荧光检测结果显示：空白组与高渗组α-SMA、E-cadherin表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；高糖组α-SMA表达水平较空白组高，E-cadherin表达水平较空白组低，差异均有统计学意义(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干预后，α-SMA表达明显减少，E-cadherin表达明显增多，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4　　各组HK-2细胞α-SMA及E-cadherin表达水平比较

*：P<0.05，与空白组比较；#：P<0.05，与高糖组比较；△：P<0.05，与高糖+低浓度ATRA组比较；▽：P<0.05，与高糖+中浓度ATRA组比较。

3　讨　　论

本研究RT-PCR结果显示，各ATRA或Y27632干预组HK-2细胞RhoA及ROCK1 mRNA表达水平均较高糖组降低，呈现ATRA浓度依赖性。且高糖组及各ATRA干预组RhoA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关。这表明高糖可通过RhoA/ROCK信号通路诱导HK-2细胞损伤，而ATRA通过抑制RhoA/ROCK信号通路能缓解由高糖引起的肾损伤。细胞免疫荧光结果显示，高糖组α-SMA表达水平较空白组明显升高，E-cadherin表达水平较空白组明显降低，予以ATRA或Y27632干预后，α-SMA表达明显减少，E-cadherin表达明显增多。免疫荧光结果提示，ATRA可通过促进HK-2细胞E-cadherin表达及减少α-SMA表达保护肾脏。

ATRA是维生素A的代谢产物，其通过调节细胞因子的产生参与机体免疫和炎性反应。最近研究表明，ATRA通过上调LIM同源盒转录因子1-β(LIM homeobox transcription factor 1-beta，LMX1B)的表达，下调TGF-β1、Ⅳ型胶原蛋白和纤维蛋白的表达，参与因缺氧(复氧)引起的肾小管上皮细胞损伤的修复[3]。Wan等[4]通过将ATRA作用于肾脏细胞后也发现，ATRA通过抑制核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表达，可减少因缺氧导致的肾损伤[4]。Molina-Jijón等[2]在糖尿病肾病(DN)动物模型中观察到，DN肾脏中常伴有ATRA代谢调节紊乱，提示ATRA的改变可能是糖尿病肾病发病起因的新特点。进一步研究显示，ATRA通过减弱氧化应激与防止肾脏紧密连接蛋白的丢失参与肾脏的保护[2]。然而，糖化清蛋白(glycated albumin，GA)在人系膜细胞中能呈剂量依赖性地增加细胞内的氧化应激及COX-2和VCAM-1分子的表达，ATRA在人系膜细胞中能将GA的这种作用放大3～4倍，被认为是DN新的病理生理特点[5]。

RhoA/ROCK信号通路是DN导致肾脏纤维化的重要通路之一，其可通过影响转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管紧张素Ⅱ、NF-κB的分泌，激活并增强其信号通路，介导肾脏纤维化[6]。国内外关于ATRA能否通过RhoA/ROCK信号通路对肾脏细胞产生影响的文献报道较少。本研究证实，ATRA可通过抑制RhoA/ROCK信号通路促进E-cadherin表达及减少α-SMA表达，缓解因高糖引起的HK-2转分化，参与肾脏保护，抑制肾脏纤维化。

[1]Zhou TB，Qin YH，Ou C，et al．All-trans retinoic acid can regulate the expressions of gelatinases and apolipoprotein E in glomerulosclerosis rats[J]．Vascul Pharmacol，2011，55(5/6)：169-177.

[2]Molina-Jijón E，Rodríguez-Muoz R，Namorado-Mdel C，et al．All-trans retinoic acid prevents oxidative stress-induced loss of renal tight junction proteins in type-1 diabetic model[J]．J Nutr Biochem，2015，26(5)：441-454.

[3]Zhou TB，Ou C，Jiang ZP，et al．Potential signal pathway between all-trans retinoic acid and LMX1B in hypoxia-induced renal tubular epithelial cell injury[J]．J Recept Signal Transduct Res，2016，36(1)：53-56.

[4]Wan X，Li X，Bo H，et al．All-trans retinoic acid protects renal tubular epithelial cells against hypoxia induced injury in vitro[J]．Transplant Proc，2013，45(2)：497-502．

[5]Alique M，Moreno-Manzano V，Sepúlveda-Muoz JC，et al．All-trans retinoic acid and glycated albumin reciprocally influence their effects in human mesangial cells[J]．Int J Vitam Nutr Res，2005，75(1)：47-53.

[6]Kolavennu V，Zeng L，Peng H，et al．Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control[J]．Diabetes，2008，57(3)：714-723.

秦晓华(1976-)，副主任医师，硕士，主要从事肾脏病的临床及基础研究。△

,E-mail:tuweiping6102@sina.com。

R587.1

B

1671-8348(2016)20-2853-03

2016-01-12

2016-03-15)

·经验交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.040