Fas/FasL在原发免疫性血小板减少症发病机制中的作用研究*

陈　燕,邢宏运,李晓明,吴鹏强,马　涛,陈　梅

(西南医科大学附属医院血液内科,四川泸州 646000)



Fas/FasL在原发免疫性血小板减少症发病机制中的作用研究*

陈燕,邢宏运△,李晓明,吴鹏强,马涛,陈梅

(西南医科大学附属医院血液内科,四川泸州 646000)

目的探讨Fas及FasL系统在成年原发免疫性血小板减少症(ITP)发病机制中的作用。方法收集成年初诊ITP患者及健康成年人外周抗凝静脉血。采用流式细胞术检测ITP患者Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞Fas及FasL的表达率、血小板表面Fas及FasL的表达率。结果与健康对照组相比，ITP组Th、Th1、Th2、Tc、Tc1、Tc2细胞表面Fas及FasL的表达率均明显升高(P<0.05)；同时ITP组血小板表面Fas的表达率明显升高(P<0.05)，而血小板表面FasL的表达无明显变化(P>0.05)。结论ITP患者T细胞亚群及血小板表面Fas及FasL表达的异常，可能与ITP发病机制密切相关。

血小板减少；Fas/FasL系统；T细胞亚群；血小板

目前，关于原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)发病机制的研究越来越多，以往研究证实ITP的发病机制主要与体液免疫异常相关，即自身抗体介导的血小板破坏增多。但近年来，多数研究表明细胞免疫因素在ITP的发病机制中也起着重要作用。本试验以初诊成年ITP患者及健康成年人外周血T淋巴细胞亚群和血小板为研究对象，检测其表面Fas及FasL蛋白的表达情况，进一步探讨细胞免疫在ITP的发病机制中的作用，从而为ITP的临床诊断和治疗提供理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料研究对象分为ITP组及对照组，ITP组25例，均符合成人初诊ITP诊断标准[1]，取自西南医科大学附属医院血液内科，其中女13例，男12例，中位年龄45岁；对照组25例，取自西南医科大学附属医院门诊健康体检者，其中女15例，男10例，中位年龄49.5岁；ITP组及对照组经患者知情同意后，取外周静脉血，肝素抗凝备测。

1.2试剂与仪器PE标记的anti-CRTH2 mAb、CY5标记的anti-CD4、CD8mAb以及小鼠抗人IgG1为Biolegend公司产品，ECD标记的anti-CD3及PC7标记的anti-CD45 mAb为Beckman Coulter公司产品，FITC标记的anti-Fas、FasLmAb及APC标记的anti-CD42b mAb为BD公司产品，流式细胞仪为美国NAVIDS Beckman Coulter。

1.3方法

1.3.1外周血T细胞亚群及其表面Fas及FasL蛋白表达率的测定取外周静脉血200 μL，加入溶血剂溶解红细胞得到白细胞悬液；设置空白对照管(ISO)及检测管(A、B、C、D)，各管加入相应抗体各5 μL，ISO：anti-IgG1-ECD、anti-IgG1-PE、anti-IgG1-CY5、anti-IgG1-FITC、anti-CD45-PC7；A: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD4-CY5、anti-Fas-FITC、anti-CD45-PC7；B: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD4-CY5、anti-FasL-FITC、anti-CD45-PC7；C: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD8-CY5、anti-Fas-FITC、anti-CD45-PC7；D: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD8-CY5、anti-FasL-FITC、anti-CD45-PC7；空白对照管及检测管各加入白细胞悬液50 μL，避光反应15 min后加入PBS缓冲液上流式细胞仪检测。

1.3.2血小板表面Fas及FasL表达率的检测设置空白对照管(ISO)及检测管(A、B)，各管加入相应抗体各5 μL，ISO：anti-IgG1-FITC、anti-CD42b-APC；A:anti-Fas-FITC 、anti-CD42b-APC；B:anti-FasL-FITC 、anti-CD42b-APC；ISO管及检测管各加入全血5 μL；避光反应25 min后加入PBS缓冲液上流式细胞仪检测。

表1　　T淋巴细胞亚群中Fas蛋白的表达情况比较±s，%)

*：P<0.05，与对照组比较。

表2　　T淋巴细胞亚群表面FasL蛋白的表达情况比较±s，%)

*：P<0.05，与对照组比较。

1.4统计学处理采用SPSS20.0进行统计分析，两样本均数满足正态性和方差齐性，采用两独立样本的t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结　　果

2.1T细胞亚群(Th、Th1、Th2、Tc、Tc1、Tc2)表面Fas/FasL的表达情况与对照组相比，ITP组T细胞亚群表面Fas蛋白的表达率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。与对照组相比，ITP组T亚群表面FasL蛋白的表达率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。流式细胞检测结果分析，以淋巴细胞群为研究对象，分别以Th1细胞(CD3+CD4+CRTH2-)及Th2细胞(CD3+CD4+CRTH2+)、Tc1细胞(CD3+CD8+CRTH2-)、Tc2细胞(CD3+CD8+CRTH2+)射门，检测其表面Fas/FasL的表达情况如图1～8所示。

图1 Th1细胞表面Fas的表达率图2 Th1细胞表面FasL的表达率图3 Th2细胞表面Fas的表达率图4 Th2细胞表面FasL的表达率

图5 Tc1细胞表面Fas的表达率图6 Tc1细胞表面FasL的表达率图7 Tc2细胞表面Fas的表达率图8 Tc2细胞表面FasL的表达率

2.2外周血血小板表面Fas及FasL蛋白的表达率与对照组相比，ITP组血小板表面Fas蛋白的表达率明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，而FasL蛋白的表达率无明显变化，见表3。流式细胞检测结果分析，根据FSC、SSC及CD42b确定血小板群， ITP组血小板表面Fas及FasL蛋白的表达情况如图9～10所示。

表3　　血小板表面Fas及FasL蛋白的表达率比较

*：P<0.05，与对照组比较。

图9　　ITP组血小板表面Fas的表达率

图10　　ITP组血小板表面FasL蛋白的表达率

3　讨　　论

Shenoy等[2]收集了20例伴有Fas基因突变的血液系统慢性自身免疫性疾病的儿童患者，研究其淋巴细胞凋亡情况，最终证实血液系统自身免疫性疾病的发生与Fas信号通路的改变密切相关。而后，Sedger等[3]发现致命性的自身免疫性血小板减少症可发生于FASL和TRAIL双敲除小鼠，提示ITP的发生与FAS/FASL信号通路密不可分。同时，不少研究[4-5]通过不同方法检测了ITP患者血清中游离状态sFas、sFasL的水平，结果发现其明显高于健康人。这些研究认为ITP患者血清中高水平的sFas及sFasL将导致 Fas及FasL蛋白的封闭，从而导致免疫下调机制失效，B淋巴细胞的凋亡减少，进一步导致抗体的持续产生，血小板的破坏增加。以上研究结果均证实ITP的发病机制与Fas/FasL信号同路密切相关。

本研究采用流式细胞术检测了成年初诊ITP患者及健康成年人外周血T细胞亚群表面Fas及FasL蛋白的表达率，结果显示：(1)与对照组相比，ITP组T细胞亚群表面Fas及FasL蛋白的表达均是明显升高的；(2)Tc细胞表面以FasL蛋白升高水平更为明显；(3)Th细胞表面以Fas蛋白升高更为明显。因此，笔者认为：ITP组Th细胞Fas及FasL表达失衡，Fas/FasL信号通路异常，导致Th细胞的自我清除减少。一方面，ITP组Th细胞增多，主要是Th1类细胞增多，其释放的细胞因子(γ-干扰素、白细胞介素-2、转化生长因子-β)增多，进一步促进Th1、CTL及NK细胞的增殖和活化，加速患者体内的血小板破坏；另一方面， Th细胞的增加，可进一步辅助B细胞产生血小板抗体，辅助Tc细胞的细胞毒性作用，最终导致血小板的破坏增加。此外，FasL主要表达于被激活的T细胞、NK细胞，其能够诱发表达Fas的T细胞发生凋亡，Fas/FasL系统参与了免疫应答过程中淋巴细胞数量的调控[6]。本研究结果中Tc细胞以FasL蛋白增高更明显，因此笔者认为ITP组活化的Tc细胞Fas/FasL凋亡途径发生异常，外周血中活化的Tc细胞增多，最终使血小板的破坏增加。

肖红等[7]检测了ITP患儿及健康儿童外周血T细胞(Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2)及血小板表面Fas及FasL的表达情况，结果提示Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2细胞Fas、FasL表达均明显升高。此外Zhong等[8]研究发现，与对照组相比，ITP组CD4+及CD8+T淋巴细胞FasL蛋白的表达都是明显增高的。本研究结果与以上研究是基本一致的。高清平等[9]采用流式细胞仪检测了健康对照组及慢性特发性血小板减少症治疗前后淋巴细胞及血小板表面Fas及FasL蛋白的表达，结果发现与健康对照组相比， ITP患者T细胞表面Fas的表达明显降低，FasL表达明显升高，与本研究结果不完全一致，其原因可能是： 本研究主要以急性ITP为研究对象，而高清平等主要以慢性ITP为研究对象； 笔者采用了多标记荧光检测，而高清平等采用的是双标记荧光检测法； 与患者个体差异及所收集标本含量不同相关。

同时笔者采用流式细胞术，以全血法处理标本，结合CD42b、FSC确定血小板群，检测其表面Fas及FasL蛋白的表达率，结果显示与肖红等的研究结果一致，ITP组血小板表面Fas表达明显升高，FasL表达无明显变化。笔者认为血小板表面Fas蛋白的表达增高，其可与活化的T淋巴细胞(即表达FasL的T淋巴细胞)结合，最终通过Fas/FasL信号通路促进血小板的凋亡。

综上所述，本试验结果表明，ITP患者T细胞亚群及血小板表面Fas、FasL的表达异常，在ITP细胞免疫功能紊乱、T细胞亚群及血小板的凋亡中起着重要作用，Fas及FasL系统可能与ITP的细胞免疫病理机制密切相关。

[1]张之南．血液病诊断及疗效标准[M]．2版．北京：科学出版社，1998．

[2]Shenoy S,Mohanakumar T,Chatila T,et al.Defective apoptosis in lymphocytes and the role of IL-2 in autoimmune hematologic cytopenias[J].Clin Immunol,2001,99(2):266-275.

[3]Sedger LM,KatewaA,Pettersen AK,et al.Extreme lymphoprolifertive disease and fatal autoimmune thrombocytopenia in FasL and TRAIL double-deficient mice[J].Blood,2010,115(16):3258-3268.

[4]Yoshimura C,Nomura S,Nagahama M,et al.Plasma-soluble Fas (APO-1,CD95) and soluble Fas ligand in immune thrombocytopenic purpura[J].Eur J Haematol,2000,64(4):219-224.

[5]Jin L,Stolpa JC,Young RM,et al.MHC class Ⅱ structural requirements for the association with Igalpha/beta,and signaling of Calcium mobilization and cell death[J].Immunol Lett,2008,116(2):184-194.

[6]Jia Rp ZX,clinical significance of CD4+CD25+Treg cells,sFas and sFasL in peripheral blood of patients with autoimmune thrombocytopenic purpura[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(5):1264-1267.

[7]肖红，刘仿，伍昌林，等．特发性血小板减少性紫癜患儿外周血T细胞亚群及血小板凋亡相关蛋白表达的研究[J]．临床血液学杂志，2007，20(5)：275-277．

[8]Zhong YG,Feng WY,Luo HQ,et al.Fas-FasL and caspase-3 signal transduction pathway and apoptosis of peripheral T lymphocytes in ITP patients[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2008,29(5):329-332.

[9]高清平，黄望香，李秀珍．慢性特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞和血小板凋亡蛋白的表达[J]．临床血液学杂志，2001，14(3)：104-106．

Study on role of Fas/FasL in pathogenesis of primary immune thrombocytopenia*

ChenYan,XingHongyun△,LiXiaoming,WuPengjiang,MaTao,ChenMei

(DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo explore the role of Fas and FasL system in the pathogenesis of adult primary immune thrombocytopenic purpura (ITP).MethodsThe peripheral anticoagulant venous blood samples were collected from the patients with newly diagnosed ITP and healthy adults.The expression rates of Fas and FasL in Th/Tc,Th1/Th2,Tc1/Tc2 cells and their expression rates at platelet surface were detected by flow cytometry.ResultsThe Fas and FasL expression rates on the surface of Th,Th1,Th2,Tc,Tc1 and Tc2 in the ITP group were increased compared with the healthy control group(P<0.05).,meanwhile the FasL expression on the platelet surface was significantly increased(P<0.05),but the expression of FasL on the platelet surface had no obvious change(P>0.05).ConclusionThe Fas and FasL expression on T cell subsets and platelet surface in ITP patients is abnormal,which may be related with the pathogenesis of ITP.

thrombocytopenia；Fas/FasL system；T cell subsets；thrombocyte

四川省卫生厅项目(110349)；泸州医学院附属医院青年人才基金[(2011)43号]。作者简介：陈燕(1986-),住院医师，硕士，主要从事血液病诊断与治疗方面的研究。△

，E-mail:xinghy52003@foxmail.com。

R558

A

1671-8348(2016)20-2795-03

2015-12-23

2016-03-06)

论著·临床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.019